cr引物的設(shè)計(jì)與實(shí)驗(yàn)操作技巧-文庫(kù)吧在線(xiàn)文庫(kù)
【正文】 好相差不要超過(guò) 3bp。精心進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，應(yīng)用熱啟動(dòng) PCR或降落 PCR或特制的DNA聚合酶（如： AmpliGold， Perkin－ Elmer）都可以避免引物二聚體的形成。 也稱(chēng)復(fù)性溫度。最常用的兩個(gè)如下： Wallace規(guī)則：是一個(gè)根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定的簡(jiǎn)便的計(jì)算公式， 可用來(lái)計(jì)算長(zhǎng)為 15－ 20個(gè)堿基的引物 在高離子強(qiáng)度額溶液中（如 1M NaCl）形成完全互補(bǔ)配對(duì)時(shí)的熔解溫度： Tm／ ?C ＝ 2（ A＋ T）＋ 4（ G＋ C）。 有些反應(yīng)甚至可將退火與延伸兩步合并 ,只用兩種溫度 (例如用 60℃ 和 94℃) 完成整個(gè)擴(kuò)增循環(huán) , 既省時(shí)間又提高了特異性。這些附加序列包括噬菌體啟動(dòng)子和GC夾子。 PCR 設(shè)計(jì)軟件推薦 ? Primer Premier 5 ? WDNASIS ? Oligo7 PCR 高保真酶推薦 ? PE公司（ ABI） Parken－ Elmer DNA聚合酶， ? TakaRa公司的 PrimeSTAR HS Polymerase， ? ToYoBo公司的 Kod－ Plus Polymerase。利用這一特點(diǎn) ,可以經(jīng)限制酶切割產(chǎn)生的平末端用酶加上 dT或 ddT,使載體與 PCR產(chǎn)物末端互補(bǔ)并進(jìn)行連接 .載體末端加 dT尾可直接用 Taq DNA聚合酶和dTTP或 ddTTP,ddTTP因缺少 3OH而不能再形成磷酸二酯鍵 ,保證在載體 339。尋找原因亦應(yīng)針對(duì)上述環(huán)節(jié)進(jìn)行分析研究。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時(shí)要平衡其濃度。或 100ul，應(yīng)用多 大體積進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，是根據(jù)科研和臨床檢測(cè)不同目的而設(shè)定， 在做小體積如 20ul 后，再做大體積時(shí)，一定要模索條件 ，否則容易失敗。 靶序列太短或引物太短 ，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性?？苫ハ嗥唇?，與引物互補(bǔ)后，可擴(kuò)增出 PCR產(chǎn)物，而導(dǎo)致假陽(yáng)性的產(chǎn)生， 這種污染可以通過(guò)更換實(shí)驗(yàn)場(chǎng)地來(lái)解決，有時(shí)也可用巢式 PCR方法來(lái)減輕或消除。 其目標(biāo)是在第一個(gè)循環(huán)中等溫度升到超過(guò)反應(yīng)物的 Tm值后才允許反應(yīng)中的一兩種關(guān)鍵成分進(jìn)入反應(yīng)。 在基因步行或企圖進(jìn)行 5‘或 3’端 RACE時(shí)，由于只有一條引物內(nèi)部的序列是已知的，經(jīng)常需要作這種變動(dòng)。 ? 另外對(duì)上一輪 PCR產(chǎn)物稀釋也降低了下一輪PCR產(chǎn)物出錯(cuò)的概率。純化模板過(guò)程中殘留的蛋白酶 K可能會(huì)降解Taq DNA聚合酶，但它在 95 ?C保溫 5分鐘很容易變性。 ? 很少或沒(méi)有產(chǎn)物可能提示 DNA樣品中存在抑制物。其原因往往由于酶量過(guò)多或酶的質(zhì)量差， dNTP濃度過(guò)高， Mg2+濃度過(guò)高，退火溫度過(guò)低，循環(huán)次數(shù)過(guò)多引起。 首先在常規(guī)條件下用 第一套跨越目的 DNA片段的引物擴(kuò)增 ，假象產(chǎn)物經(jīng)常會(huì)與引物中的一條或兩條配對(duì)，但其內(nèi)部卻是無(wú)關(guān)序列。其次是酶的質(zhì)和量 ，往往一些來(lái)源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來(lái)源的酶則不出現(xiàn)，酶量過(guò)多有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。 熱蓋與非熱蓋 PCR儀 ? 早期的 PCR儀均為非熱蓋，因此每個(gè) PCR反應(yīng)管中需要加入無(wú)菌石蠟油，以防止溶液的蒸發(fā)。 ? 需注意的是有時(shí) PCR失敗是由于忘加了酶。 通常模板發(fā)生變異的主要原因是模板切膠回收時(shí)間過(guò)長(zhǎng)（一般應(yīng)控制在 1分鐘以?xún)?nèi)）或無(wú)意中將模板置于超凈工作臺(tái)中滅菌所致。T的 TVector。 ? 1. 平末端連接 ：由于 Taq DNA聚合酶往往在 PCR產(chǎn)物 339。每一種限制性?xún)?nèi)切酶與其對(duì)應(yīng)的 最佳保護(hù)堿基請(qǐng)到 NEB公司網(wǎng)站或互聯(lián)網(wǎng)上查詢(xún) 。如果可能的話(huà)，每個(gè)引物的 3‘末端堿基應(yīng)為 G或 C，不能為 A。在公式中， n是寡核苷酸引物的堿基數(shù)。 其中，變性溫度和延伸溫度對(duì)于每個(gè) PC
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