cr引物的設(shè)計(jì)與實(shí)驗(yàn)操作技巧(已修改)
2025-01-18 16:38 本頁(yè)面
【正文】 微生物基因工程 李剛 副教授 教學(xué)內(nèi)容 ? 一、 PCR引物的設(shè)計(jì)與實(shí)驗(yàn)操作技巧； 二、基因組文庫(kù)的建立與篩選； 三、定向進(jìn)化技術(shù)在微生物酶制劑研究中 ? 的應(yīng)用； 四、原核表達(dá)系統(tǒng)的選擇和高效表達(dá)策略； ? 五、真核表達(dá)系統(tǒng)的選擇和高效表達(dá)策略。 一、 PCR引物的設(shè)計(jì)與實(shí)驗(yàn)操作技巧 ? 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、分子克隆及 DNA序列分析這三大類實(shí)驗(yàn)方法幾乎構(gòu)成了現(xiàn)代分子生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)工作的基礎(chǔ)。而三者中，PCR方法在理論上出現(xiàn)最早，在實(shí)踐中應(yīng)用得最廣泛。 PCR反應(yīng)的七種基本成份 ? 熱穩(wěn)定 DNA聚合酶。 ? 一對(duì)特異的引導(dǎo) DNA合成的寡核苷酸引物。 ? dNTP（混合液：標(biāo)準(zhǔn) PCR反應(yīng)包含 4種等摩爾濃度的脫氧核苷三磷酸，即 dATP、 dTTP、 dCTP和 dGTP。 ? 二價(jià)陽(yáng)離子。所有的熱穩(wěn)定 DNA聚合酶都要求有游離的二價(jià)陽(yáng)離子，通常是 Mg2+用于激活。 ? 一價(jià)陽(yáng)離子。標(biāo)準(zhǔn) PCR緩沖液內(nèi)包含有 50 mmol/L的 KCl，它對(duì)于擴(kuò)增大于 500 bp的 DNA片段是有益的，提高 KCl濃度在約 70－100mmol/L范圍內(nèi)對(duì)改善擴(kuò)增較短的 DNA片段產(chǎn)物是有利的。 ? 模板 DNA。含有靶序列的模板 DNA科研單鏈或雙鏈形式加入 PCR混合液中。閉環(huán) DNA模板的擴(kuò)增效率略低于線性 DNA。盡管模板 DNA的長(zhǎng)短不是 PCR擴(kuò)增的關(guān)鍵因素，但當(dāng)使用高分子量的 DNA（ 10kb）作模板時(shí)，如用限制性內(nèi)切酶先行消化（此酶不應(yīng)切割其中的靶序列），則擴(kuò)增效果更好。 PCR引物設(shè)計(jì)的幾條原則： ? ① 引物長(zhǎng)度 ? 一般引物長(zhǎng)度為 1830堿基就足夠了。 特殊情況下（比如 Tm值或 GC含量不合適） 可以進(jìn)一步延長(zhǎng)到5060 bp長(zhǎng)度。 但超過(guò) 60bp的引物長(zhǎng)度比較少見(jiàn)。原因一是超過(guò) 60bp長(zhǎng)度的引物比較難以合成，因此合成價(jià)格大幅度增加。另外長(zhǎng)引物在合成的時(shí)候出錯(cuò)率也顯著增加。 ? 上下游引物的長(zhǎng)度應(yīng)該基本相等，最好相差不要超過(guò) 3bp。 2. 堿基組成 ? G＋ C含量應(yīng)在 40％到 60％之間 ， 4種堿基要在引物中分配均勻。若是引物存在嚴(yán)重的GC傾向或 AT傾向則 可以在引物 5’端加適量的A、 T或 G、 C尾巴。 3. 重復(fù)和自身互補(bǔ)序列 ? 不能有大于 3bp的重復(fù)序列或自身互補(bǔ)序列存在。 這種序列可形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，如果這種結(jié)構(gòu)在 PCR條件下穩(wěn)定，它會(huì)非常有效地阻止寡聚核苷酸和靶 DNA之間的復(fù)性 。 4．上下游引物的互補(bǔ)性 ? 一個(gè)引物的 3‘端不允許結(jié)合到另一個(gè)引物的任何位點(diǎn)上。 因?yàn)樵?PCR中引物的濃度往往是比較高，所以即使引物間微弱的互補(bǔ)，都會(huì)導(dǎo)致引物間形成雜交，隨后是引物二聚體的形成和擴(kuò)增。如果引物二聚體在 PCR早期形成，它將和 DNA聚合酶、引物及核苷酸競(jìng)爭(zhēng)進(jìn)而抑制靶 DNA的擴(kuò)增。精心進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，應(yīng)用熱啟動(dòng) PCR或降落 PCR或特制的DNA聚合酶（如： AmpliGold， Perkin－ Elmer）都可以避免引物二聚體的形成。 當(dāng)在一個(gè) PCR中應(yīng)用多對(duì)引物時(shí)，請(qǐng)注意檢查任何一個(gè) 3’末端都不能和其他任何引物互補(bǔ)。 5. 解鏈溫度（ Tm） ? 解鏈溫度（ Tm）： 也稱熔化溫度。 計(jì)算出來(lái)的兩個(gè)引物的 Tm值相差不能大于 5 ?C。擴(kuò)增產(chǎn)物的 Tm值與引物的 Tm值相差不能大于 10 ?C。 這些特性保證了擴(kuò)增產(chǎn)物在每個(gè)PCR循環(huán)可有效地變性。 為什么要計(jì)算引物的解鏈溫度 ? 因?yàn)?PCR的進(jìn)行需要確定三個(gè)溫度。 第一
公司管理相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號(hào)-1