【文章內(nèi)容簡介】 菌等，部分霉菌 和非致病性大腸桿菌也可以是益生菌 [19]。 乳酸菌 乳酸菌（ Lactic acid bacteria），是一類通過發(fā)酵糖類獲得能量，從而產(chǎn)生大量乳酸的 無芽孢、革蘭氏 陽性細菌的總稱，包括乳桿菌和乳鏈菌 [20]。 乳酸菌可用于制造酸奶、乳酪、酒、 腌漬食品 等 。我國發(fā)酵劑中使用的乳酸菌有保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球 菌、嗜酸乳桿菌、兩歧雙歧桿菌 等，在生產(chǎn)中最常用的是保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的混合菌種純培養(yǎng)發(fā)酵劑 [2122]。 益生菌的篩選 3 酵母菌 酵母菌是一種細胞形狀呈圓形、卵圓形、橢圓形或柱形 ，無 性繁殖的 單細胞 真菌 。 主要有釀酒酵母及產(chǎn)脂酵母，酵母菌在酒精發(fā)酵階段 有著 重要角色，為后續(xù)的醋化階段提供底物 —乙醇，但是進入釀醋發(fā)酵階段后，數(shù)量則急劇減少，發(fā)酵結(jié)束后，幾乎完全消失。優(yōu)良酵母菌 的 特性 為 [23]：發(fā)酵前期繁殖速度快 、 發(fā)酵產(chǎn)酒精能力強 、 有一定的后繁殖能力 、能產(chǎn)生較好較多的香味物質(zhì) 、 生理耐性好 等 [24]。分離鑒定酵母菌，可以為研究酵母菌在酵素等產(chǎn)品發(fā)酵過程中的生物特性的研究提供了一定的基礎(chǔ) [25]。 霉菌 霉菌是絲狀真菌的通稱。其菌落一般較大，菌絲呈長管、分枝狀，無橫隔壁，具多個細胞 核，并會聚成菌絲體。霉菌通 常用孢子的顏色來稱呼，如黑霉菌 或 紅霉菌 。 在許多產(chǎn)品生產(chǎn)過程中，霉菌起著非常重要的作用。霉菌 能產(chǎn)生許多酶類 ，在酒類釀造過程中起糖化作用 [2628]。 益生菌的作用 預防或緩解腹瀉 據(jù)報道，飲食習慣不良或服用抗生素會引起腸道菌群失 衡，從而導致腹瀉等癥狀。若經(jīng)常服用含益生菌的保健食品 ， 有助于恢復正常的腸道 pH 值和腸道菌群的平衡， 可 預防或緩解腹瀉癥狀 [29]。 促進腸道消化系統(tǒng)健康 許多益生菌可在胃腸道內(nèi)產(chǎn)生消化酶，這些酶 可使 人體更好地消化 食物 及其營養(yǎng)成分。益生菌可以抑制有害菌在腸道內(nèi)的繁殖和進入血液循環(huán)系統(tǒng)，減少毒素，促進腸道蠕動，從而提高腸道機能，改善排便狀況。如嗜酸乳桿菌可分泌乳糖酶，分解乳糖，從而緩解乳糖不耐癥。 增強人體免疫功能 腸道內(nèi)存在非常發(fā)達的免疫系統(tǒng)，但 人體的免疫功能會隨著年齡的增長而降低。研究表明 ， 益生菌可以通過刺激腸道內(nèi)的免疫機能，將過低或過高的免疫活性調(diào)節(jié)到正常狀態(tài)[30]。 益生菌的免疫調(diào)節(jié)作用有助于抗癌與抑制過敏性疾病。 益生菌對 細胞免疫調(diào)節(jié)作用、體液免疫調(diào)節(jié)作用和非特異性免疫調(diào)節(jié)作用 都有一定的福州大學至誠學院本科生畢業(yè)設(shè)計 (論文 ) 4 影響 。如雙 歧桿菌在動物體內(nèi)能夠刺激 B 淋巴細胞活化、增殖和分泌抗體，來發(fā)揮體液免疫功能 [31]?？茖W研究表明，益生菌對宿主細胞免疫系統(tǒng)具有正面作用如增強抵抗力。 降低血脂膽固醇 [32] 益生茵可吸附食物中的膽固醇，促使其排出體外 [33]。益生菌還能吸附腸內(nèi)的膽汁酸，增強膽固醇轉(zhuǎn)化成膽汁酸，從而減輕血清中膽固醇的含量 [34]。 Kawase 等研究證實，乳酸菌屬和鏈球菌屬的發(fā)酵產(chǎn)物能降低血液中總膽固醇水平，增加高密度脂蛋白水平。Kanagawa 等從啤酒酵母和瑞士乳酸桿菌發(fā)酵乳中分離的三肽物質(zhì)具有抑制血管緊 張素轉(zhuǎn)移酶活性的作用 [35]。 大量科學研究證實酸牛奶中富含益生菌，可降低膽固醇水平，長期補充益生菌還可預防骨質(zhì)疏松。 已申報具有降低血脂脂膽固醇功能的專利菌株非常多，如： RP32 等 [36]。研究表明， 益生菌降低血脂膽固醇水平的作用機制可能包括膽鹽的脫結(jié)合 、 膽固醇摻入細胞膜 、 益生菌對膽固醇的吸收 、 菌體對膽固醇的吸附 、 菌體對膽固醇的轉(zhuǎn)化等。 預防陰道感染 酸牛奶中的嗜酸乳桿菌可抑制陰道內(nèi)白色念珠菌的繁殖。在歐洲所做的雙盲對照試驗證實了益生菌有預防陰道感染的作用。 產(chǎn)生重要的營養(yǎng)物質(zhì) 益生菌能產(chǎn)生維生素、短鏈脂肪酸、氨基酸等，對骨骼成長和心臟健康起重要 作用。益生菌 可分解脂肪、蛋自質(zhì)和糖，有利于消化吸收 [37]。李新紅 [38]等在健康成體獐的基礎(chǔ)口糧中添加了復合酶和益生菌制劑進行消化代謝試驗，發(fā)現(xiàn)添加復合酶和益生菌后，能夠顯著提高獐對糧食中粗蛋自、粗纖維和礦物質(zhì) 等 營養(yǎng)物質(zhì)的利用率。 益生菌的應用 雙歧桿菌、乳桿菌、大腸桿菌、 蠟樣芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和酵母菌等益生菌是目前應用最廣的。益生菌 的功效越來越受關(guān)注 ,已在食品工業(yè)特別是發(fā)酵乳品工業(yè)中得到了廣泛 的應用 [39]。益生菌理論的研究己在國內(nèi)外進入高潮的同時，益生菌的應用也已形成了強大的產(chǎn)業(yè)。目前國內(nèi)外益生菌的應用主要有以下幾方面。 益生菌食品 益生菌食品指含有存活且有益于人體健康益生菌的食品。益生菌 較多應用于 發(fā)酵乳制益生菌的篩選 5 品 。另外在一些面包、餅干等食品中也有添加。 益生菌酸奶 益生菌酸奶是以益生菌為主要菌種所生產(chǎn)的發(fā)酵乳。它可緩沖胃液和膽汁的 pH，服用其制成的片劑或膠囊，益生菌更容易通過人體消化道，促進健康作用。 益生菌乳制品 益生菌乳制品指在一般乳制品中添加益生菌 的食品。 應用于 奶粉制品 比較多 ， 如 歐美國家 在 發(fā)酵乳飲料和液態(tài)奶 中 添加乳桿菌和雙歧桿菌 。 有研究表明向干酪中添加糞腸球菌， 有保健作用 的同時 ，還 可 改善 其 品質(zhì) [40]。 益生菌谷物制品 益生菌在 80 年代中期前后應用于谷物制品，由于其生產(chǎn)較復雜，所以品種不多。 美國威斯康星大學的學生 為 Mamp。M 公司開發(fā)了一種 松脆曲奇 ，里面加有 長雙岐桿菌和嗜酸乳桿菌等益生菌的 [41]。 益生菌保健品 保健品是用益生菌配合其他物質(zhì)制成的，主要包括益生菌保健食品和益生菌藥品。我國益生菌制品主要以藥 品形式被大家接受。微 生態(tài)調(diào)節(jié)劑 可用于 健康人 ，增進健康素質(zhì)，提高健康水平，同時也會產(chǎn)生治療與防病的目的。我國現(xiàn)有益生菌制劑有媽咪愛、促菌生、金雙岐、益菌生、乳康生等品牌。 益生菌存在的問題 益生菌的作用已被人們接受，其在發(fā)酵食品或食品添加劑有許多的應用，但也存在許多有待解決的問題，如 :① 目前已經(jīng)確認的適宜的益生菌菌種不多，僅有乳酸桿菌、鏈球菌、芽抱桿菌、雙歧桿菌及酵母等種屬； ② 一些產(chǎn)品中的益生菌在加工、運輸過程中易失活；③ 有些活菌 難以 經(jīng)受低 PH 值的胃酸、膽汁酸及胰液等的作用，數(shù)量 少， 難以發(fā)揮作用；④ 關(guān)于益生菌在體內(nèi)的作用 機理的還不明確，許多學說相互矛盾。 福州大學至誠學院本科生畢業(yè)設(shè)計 (論文 ) 6 酵素 酵素的定義、作用及應用 酵素 (enzyme)又稱為酶，是產(chǎn)生于生物體中具有催化作用的活性大分子 [42]。酵素可催化生物體內(nèi)幾乎所有的生理生化反應。人體的能量攝取、新陳代謝、成長和繁殖等生命現(xiàn)象，都必須通過酵素的幫助才能完成。體內(nèi)酵素含量和活性的高低，影響著人體的病變和衰老。隨著年齡的增大，人體內(nèi)的酵素數(shù)量與活力呈下降趨勢?；疾≌唧w內(nèi)的酵素代謝往往是紊亂的，應適當補充特定種類的酵素，可使人體恢復健康且維持良好的狀態(tài)。因此，現(xiàn)在酵素已被廣泛應用于食品 和保健品當中。此外，酵素具有分解老化細胞、清潔皮膚、淡化皺紋、消除青春痘、徹底改善肌膚狀況等美容功效，還有去除油脂等減肥作用。因此，酵素已經(jīng)開始應用于化妝品行業(yè)。 評價微生物酵素的指標 微生物酵素 含有豐富的酶、維生素、礦物質(zhì)和次生代謝產(chǎn)物 等 。微生物酵素中的功效酶有蛋白酶、脂肪酶和超氧化物歧化酶等。蛋白酶能催化蛋白質(zhì)水解，在人體中的主要作用是分解食物中蛋白質(zhì)和 死亡的細胞，促進營養(yǎng)物質(zhì)的吸收， 有 美容效果。 脂肪酶是一類水解油脂的酶， 起分解油脂 的作用， 有 減肥、 保健 效果 。超氧化物歧化酶 (SOD)是一種特殊 的金屬酶，可以 清除機體內(nèi)超氧陰離子， 可 防衰老、抗輻射、抗炎和防治腫瘤等 。 因此，評價微生物酵素的指標主要是以上 3種酶的含量和活力。除此之外還有總酚含量、還原力、 DPPH自由基清除能力 和 ABTS自由基清除能力等都可以作為指標，可以系統(tǒng)的考察微生物酵素的抗氧化活力 [43]。 本課題主要研究的內(nèi)容和意義 研究內(nèi)容 (1)初篩：把酸奶、酒、酒曲和自制酵素 [44]樣品稀釋后分別涂布于 MRS、 PDA、孟加拉紅培養(yǎng)基上倒置培養(yǎng)，富集、分離出乳酸菌、酵母菌和霉菌，并編號保藏。 (2)復篩：對初篩得到的菌株 進一步分離純化。 (3)菌種鑒定：菌株形態(tài)學觀察、分子生物學鑒定、生理生化鑒定。 (4)應用初探：測定初篩菌株的蛋白酶活 力 ，得酶活高的乳酸菌和酵母菌，參考徐祖炎[45]的專利制成酵素，探究其蛋白酶活力的變化。 益生菌的篩選 7 本課題研究的意義 （ 1）研究結(jié)果有助于進一步了解 酸奶、酒、酒曲、自制酵素 中微生物的種類； （ 2）對改良酵素生產(chǎn)工藝及設(shè)備，提高產(chǎn)品產(chǎn)量與功能性及技術(shù)創(chuàng)新有重要的參考價值； （ 3）篩選的菌株是實驗室科研工作上寶貴的資源，為進一步研究 提供菌種 。 福州大學至誠學院本科生畢業(yè)設(shè)計 (論文 ) 8 第 2 章 實驗材料與方法 材料與主要設(shè)備 實驗材料 （ 1）蒙牛酸奶； （ 2）福建省三明 市尤 溪縣的酒和酒曲； （ 3）自制酵素 [44]：紅糖：水果：蒸餾水 =1： 3： 10，自然發(fā)酵 6090 天，得棕黃色上清即為 果蔬酵素。 培養(yǎng)基 （ 1） MRS 培養(yǎng)基 ： 10g 蛋白胨， 10g 牛肉浸膏， 5g 酵母浸膏， 20g 葡萄糖， 5g 醋酸鈉， 1mL 吐溫 80， 2g 檸檬酸氫二胺， 2g MgSO47H2O， MnSO44H2O， 2g K2HPO4，蒸餾水 1000mL，瓊脂 20g， 2% CaCO3， pH 。 121℃ 高壓蒸汽滅菌 20 min。 （ 2） PDA 培養(yǎng)基 ： 馬鈴薯 200g，葡萄糖 20 g，蒸餾水 1000 mL，瓊脂 20 g。 121℃高壓蒸汽滅菌 20 min。 （ 3） 孟加拉紅培養(yǎng)基： 蛋白胨 5g， 葡萄糖 10g，磷酸二氫鉀 1g， MgSO47H2O ，瓊脂 20g， 1/3000 孟加拉紅溶液 100mL，蒸餾水 1000mL，氯霉素 。 121℃ 高壓蒸汽滅菌 20 min。 （ 4） LB 培養(yǎng)基：胰蛋白胨 %， NaCl %，酵母提取物 %，蒸餾水定容，PH 調(diào)至 ， 121℃ 蒸汽滅菌 20min。 （ 5）糖發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基： 麥芽粉：溫熱水（ 6065℃ ） =1:4， 60℃ 保溫糖化 3 小時，碘液檢查后 4 層紗布過濾， 加 入 雞 蛋白和水各 20mL，調(diào)勻、攪拌煮沸后再用 4 層紗布過濾，濾液 滅菌備用 以上不加瓊脂即為液體培養(yǎng)基，否則為固體培養(yǎng)基。 主要試劑 （ 1）草酸銨結(jié)晶紫染液 溶液 A:結(jié)晶紫 2g； 95%酒精 20mL。 溶液 B：草酸銨 ；蒸餾水 80mL。 A、 B 溶液混合，用濾紙過濾后即可使用。 益生菌的篩選 9 （ 2）盧戈氏碘液： 碘 ，碘化鉀 ，蒸餾水 300mL。將碘化鉀溶于少量蒸餾水中后 ， 加入碘使 其 完全溶解， 最后 加蒸餾水 滴定 至 300mL。配成后貯于棕色瓶內(nèi)備用 。 （ 3）呂 氏堿性美藍染色液 : A 液：美藍 ； 95%乙醇 30mL。 B 液： % KOH l00mL。 A、 B 溶液混合，可稀釋使用 。 （ 4）乳酸石灰酸棉藍染色液： 石炭酸 (結(jié)晶酚 ) 20g，乳酸 20mL，甘油 40mL，棉藍 ，蒸餾水 20mL。 先 將棉藍溶于蒸餾水中，再加入其他成分，微加熱溶解，冷卻 備 用。 （ 5）無水乙醇、蒸餾水 （ 6） DNA 抽提收試劑盒（細菌）、 DNA 膠回收試劑盒、 PCR2MIX、 SolutionⅠ 、PMD18T：生工生物工程（上海）股份有限公司 。 （ 7） 磷酸氫二鈉 –磷酸二氫鈉緩沖液： 配法見附錄 1。 （ 8） 100μg/mL賴氨酸標準溶液： 稱取于 105℃ 干燥冷卻后的賴氨酸 ，用 1moL/L 鹽酸 60mL 溶解后定容至100mL，即為 1mg/mL 賴氨酸標準液。吸取 1mg/mL 賴氨酸標準液 10mL，用 酸稀釋定容至 100ml，即為 100μg/mL的賴氨酸標準液。 （ 9） 1%茚三酮溶液：茚三酮 1g，加無水乙醇溶解，定容至 100mL。 （ 10） 10g/L 酪蛋白溶液：酪素 ，精確至 ， 少量 ，加入 磷酸氫二鈉 –磷酸二氫鈉緩沖液 80mL， 在沸水中邊加熱邊攪拌 溶解，冷卻定容到100mL， 4℃ 保存。 主要儀器設(shè)備 本課題實驗過程中用到的主要儀器和設(shè)備見表 21： 表 21 主要儀器和設(shè)備說明表 儀器名稱 儀器型號 生產(chǎn)廠家 潔凈工作臺 SWCJ2FD 型 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠 生化培養(yǎng)箱 LRH190 型 廣東省醫(yī)療器械廠 電子天平 ISO 9001 型 賽多利斯科學儀器（北京）有限公司 恒溫磁力加熱攪拌器 852 型 上海江星儀器有限公司 pH 計 UB7 型 DENVER INS