【正文】 ........... 8 主要試劑 ................................................................................................................. 8 主要儀器設(shè)備 ......................................................................................................... 9 實驗方法 ......................................................................................................................... 10 菌株篩選 ............................................................................................................... 10 菌株蛋白酶活力的測定 ........................................................................................ 11 菌株鑒定 ............................................................................................................... 11 菌株作用于酵素中的初探 ............................................................................................. 14 第 3 章 實驗結(jié)果與討論 ............................................................................................................. 15 益生菌菌株的篩選 ......................................................................................................... 15 IV 初篩 ....................................................................................................................... 15 復(fù)篩 ....................................................................................................................... 15 菌株蛋白酶活力的測定 ................................................................................................. 16 賴氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 ........................................................................................ 16 菌株蛋白酶活力的測定 ....................................................................................... 16 菌株鑒定 ......................................................................................................................... 17 菌落形態(tài)及菌體形態(tài)觀察 ................................................................................... 17 L4 菌株分子生物學(xué)鑒定 ....................................................................................... 25 L4 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 ........................................................................................... 26 L4 的生理生化實驗 ............................................................................................... 26 L4 和 Y5 菌株應(yīng)用于酵素的初步探究 .......................................................................... 27 結(jié)論與展望 ................................................................................................................................... 28 結(jié)論 ........................................................................................................................................ 28 展望 ........................................................................................................................................ 28 參考文獻 ....................................................................................................................................... 29 謝辭 ............................................................................................................................................... 33 附錄 1 磷酸氫二鈉 –磷酸二氫鈉緩沖液配制表 ......................................................................... 34 附錄 2 L4 基因序列 ...................................................................................................................... 35 益生菌的篩選 1 第 1 章 緒論 益生菌概述 益生菌與人類的健康有著密切的關(guān)系，是人體的生態(tài)調(diào)節(jié)劑 [1]，可以維持腸道的菌落平衡和抑制病原菌的生長 [2]。 益生菌 理論 的產(chǎn)生 人體含有大量的微生 物， 定居于人 體的各個部位 [5]。微生物對無菌動物的感染 比較 敏感 [6]，因為 其免疫系統(tǒng)低下和缺乏 ―競爭性定植 ‖。 人體內(nèi)共生的微生物對宿主的影響利弊共存。弊是有些微生物可能與宿主之間構(gòu)成病原關(guān)系，引起宿主的 疾病、衰老或死亡。正是出于對人體微生物作用的認(rèn)識和要對微生物區(qū)系趨利避害的想法，促使了益生菌理論的產(chǎn)生 [11]。 1965年被 Lilley和 Stillwell 闡述為 ―由一種微生物分泌的刺激其他微生物生長的物質(zhì)或組織提取物 ‖。 國際營養(yǎng)學(xué) 界 普遍 認(rèn)可益生菌是一種對人體有益的 菌，它們可直接作為食品添加劑服用， 從而 維持腸道菌叢的平衡 [13]。 益生菌作用基本機理概述 益生菌被攝入宿主腸道后，在復(fù)雜的微生態(tài)環(huán)境中與近 400 種正常菌群匯合，改變生物體內(nèi)的微生物群落，促進宿主的健康。② 菌群屏障學(xué)說 。 福州大學(xué)至誠學(xué)院本科生畢業(yè)設(shè)計 (論文 ) 2 益生菌的來源 益生菌的來源相當(dāng)廣泛 ， 新鮮的 果蔬 中 、 人體糞便 、 母乳 、 發(fā)酵乳制品、傳統(tǒng)發(fā)酵植物食品 等都存在益生菌 。 許多研究人員認(rèn)為，益生菌來源與其特殊的商業(yè)化應(yīng)用有著非常密切的關(guān)系；但 FAO/WHO 專家建議，益生菌特定的生理作用比其來源更加重要。到現(xiàn)在為止，市場上還未出現(xiàn)基因工程改造的益生菌。其特征如下： ① 源于宿主并對宿主健康有一定的促進作用； ② 能抵抗 人體內(nèi)各種 酶及膽汁 的 消化作用，能 正常生活于胃腸道中； ③ 能 抑制腸內(nèi)病原體 活性； ④ 通過產(chǎn)生細菌素或抗菌的代謝產(chǎn)物等，選擇性的調(diào)節(jié)微生物區(qū)系 的組成 ； ⑤ 是公認(rèn)安全的微生物； ⑥ 準(zhǔn)確識別菌 及其特性， 有己被證明的安全性； ⑦ 其制品按合理劑量服用時能具有臨床有效性； ⑧ 能 是益生菌產(chǎn)品 保持活性和穩(wěn)定性， 同時能用于大量生產(chǎn)并具有經(jīng)濟價值。大體上益生菌可分為乳酸菌、酵母菌和霉菌 3大類。此外，還有一些酵母菌，如釀酒酵母菌、布氏酵母菌等，部分霉菌 和非致病性大腸桿菌也可以是益生菌 [19]。 乳酸菌可用于制造酸奶、乳酪、酒、 腌漬食品 等 。 益生菌的篩選 3 酵母菌 酵母菌是一種細胞形狀呈圓形、卵圓形、橢圓形或柱形 ，無 性繁殖的 單細胞 真菌 。優(yōu)良酵母菌 的 特性 為 [23]：發(fā)酵前期繁殖速度快 、 發(fā)酵產(chǎn)酒精能力強 、 有一定的后繁殖能力 、能產(chǎn)生較好較多的香味物質(zhì) 、 生理耐性好 等 [24]。 霉菌 霉菌是絲狀真菌的通稱。霉菌通 常用孢子的顏色來稱呼，如黑霉菌 或 紅霉菌 。霉菌 能產(chǎn)生許多酶類 ，在酒類釀造過程中起糖化作用 [2628]。若經(jīng)常服用含益生菌的保健食品 ， 有助于恢復(fù)正常的腸道 pH 值和腸道菌群的平衡， 可 預(yù)防或緩解腹瀉癥狀 [29]。益生菌可以抑制有害菌在腸道內(nèi)的繁殖和進入血液循環(huán)系統(tǒng)，減少毒素，促進腸道蠕動，從而提高腸道機能，改善排便狀況。 增強人體免疫功能 腸道內(nèi)存在非常發(fā)達的免疫系統(tǒng)，但 人體的免疫功能會隨著年齡的增長而降低。 益生菌的免疫調(diào)節(jié)作用有助于抗癌與抑制過敏性疾病。如雙 歧桿菌在動物體內(nèi)能夠刺激 B 淋巴細胞活化、增殖和分泌抗體，來發(fā)揮體液免疫功能 [31]。 降低血脂膽固醇 [32] 益生茵可吸附食物中的膽固醇，促使其排出體外 [33]。 Kawase 等研究證實，乳酸菌屬和鏈球菌屬的發(fā)酵產(chǎn)物能降低血液中總膽固醇水平，增加高密度脂蛋白水平。 大量科學(xué)研究證實酸牛奶中富含益生菌，可降低膽固醇水平，長期補充益生菌還可預(yù)防骨質(zhì)疏松。研究表明， 益生菌降低血脂膽固醇水平的作用機制可能包括膽鹽的脫結(jié)合 、 膽固醇摻入細胞膜 、 益生菌對膽固醇的吸收 、 菌體對膽固醇的吸附 、 菌體對膽固醇的轉(zhuǎn)化等。在歐洲所做的雙盲對照試驗證實了益生菌有預(yù)防陰道感染的作用。益生菌 可分解脂肪、蛋自質(zhì)和糖，有利于消化吸收 [37]。 益生菌的應(yīng)用 雙歧桿菌、乳桿菌、大腸桿菌、 蠟樣芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和酵母菌等益生菌是目前應(yīng)用最廣的。益生菌理論的研究己在國內(nèi)外進入高潮的同時，益生菌的應(yīng)用也已形成了強大的產(chǎn)業(yè)。 益生菌食品 益生菌食品指含有存活且有益于人體健康益生菌的食品。另外在一些面包、餅干等食品中也有添加。它可緩沖胃液和膽汁的 pH，服用其制成的片劑或膠囊，益生菌更容易通過人體消化道，促進健康作用。 應(yīng)用于 奶粉制品 比較多 ， 如 歐美國家 在 發(fā)酵乳飲料和液態(tài)奶 中 添加乳桿菌和雙歧桿菌 。 益生菌谷物制品 益生菌在 80 年代中期前后應(yīng)用于谷物制品，由于其生產(chǎn)較復(fù)雜，所以品種不多。M 公司開發(fā)了一種 松脆曲奇 ，里面加有 長雙岐桿菌和嗜酸乳桿菌等益生菌的 [41]。我國益生菌制品主要以藥 品形式被大家接受。我國現(xiàn)有益生菌制劑有媽咪愛、促菌生、金雙岐、益菌生、乳康生等品牌。 福州大學(xué)至誠學(xué)院本科生畢業(yè)設(shè)計 (論文 ) 6 酵素 酵素的定義、作用及應(yīng)用 酵素 (enzyme)又稱為酶，是產(chǎn)生于生物體中具有催化作用的活性大分子 [42]。人體的能量攝取、新陳代謝、成長和繁殖等生命現(xiàn)象，都必須通過酵素的幫助才能完成。隨著年齡的增大，人體內(nèi)的酵素數(shù)量與活力呈下降趨勢。因此，現(xiàn)在酵素已被廣泛應(yīng)用于食品 和保健品當(dāng)中。因此，酵素已經(jīng)開始應(yīng)用于化妝品行業(yè)。微生物酵素中的功效酶有蛋白酶、脂肪酶和超氧化物歧化酶等。 脂肪酶是一類水解油脂的酶， 起分解油脂 的作用， 有 減肥、 保健 效果 。 因此，評價微生物酵素的指標(biāo)主要是以上 3種酶的含量和活力。 本課題主要研