【正文】 展望 結合 L4 的鑒定結果，查閱相關資料，可知 其是益生菌，其 他分離獲得的菌株還待鑒定，很可能 為有益菌， 有些可能會是已發(fā)現(xiàn)的菌株，也有可能出現(xiàn)新的菌株，它們 有廣闊的應用前景，是實驗室科研工作上寶貴的資源。 20 天后測得對照組（不加菌）的蛋白酶活力為 ，實驗組（加 L4 和 Y14）的蛋白酶活力為。 L4 系統(tǒng)發(fā)育樹的構建 將 L4經(jīng)過 16SrDNA鑒定，去除載體重新拼接的序列附在附錄 2,將此序列通過 NCBI網(wǎng)站的 BLAST程序進行序列同源性搜索，并構建系統(tǒng)發(fā)育樹。乳酸菌中 L4 的蛋白酶活最高，為 ；酵母菌中 Y14 的酶活最高，為 ；霉菌中 M14 酶活最高，為 。由經(jīng)驗得富集菌株是可直接將樣品稀釋成 103梯度涂布于平板，在樣品量大的情況下可以節(jié)省許多時間。 （ 6）菌液 PCR ① 挑 取 轉化平板中的菌于 LB 液體培養(yǎng)基中， 37℃ 、 200rpm培養(yǎng) 5h，獲得菌液； ② 菌液 PCR 步驟、條件、體 系同（ 2），引物不同； ③ 菌液 PCR 擴增，通用驗證引物序列如下： 正向引物 M13F47： 5’CgCCAgggTTTTCCCAgTCACgAC3’ 反向引物 M13R48： 5’ AgCggATAACAATTTCACACAggA3’ （ 7）用 1%瓊脂糖凝膠電泳對菌液 PCR 產(chǎn)額進行電泳、驗證后， 將菌液送上海英濰捷基貿(mào)易有限公司進行測序。 益生菌的篩選 11 菌株蛋白酶活力的測定 賴氨酸標準曲線的制作 表 22 賴氨酸標準曲線制作表 試劑 試管號 0 1 2 3 4 5 100μg/mL標準氨基酸溶液（ mL） 蒸餾水（ mL） 1%茚三酮溶液（ mL） 570nm 吸光值 0 蛋白酶活力的測定 ① 測定方法（吸光光度法） 試管 A（空白，平行 2 份 ） → 加蒸餾水 1ml（ 80℃ 水浴 10min） → 加酪蛋白 1ml（ 40℃水浴 10min） → 加 1%茚三酮 1ml（ 沸水浴， 15min） → 于 570nm測定 Abs 試管 B（酶試樣，平行 2 份 ） → 酶液 1ml+酪蛋白 1ml（ 40℃ 水浴 10min； 80℃ 水浴 10min）→ 加 1%茚三酮 1ml（ 沸水浴， 15min） → 于 570nm測定 Abs ② 計算公式：根據(jù)標準曲線和測得的 y值求出賴氨酸含量 x值。 （ 8） 100μg/mL賴氨酸標準溶液： 稱取于 105℃ 干燥冷卻后的賴氨酸 ，用 1moL/L 鹽酸 60mL 溶解后定容至100mL，即為 1mg/mL 賴氨酸標準液。配成后貯于棕色瓶內備用 。 121℃ 高壓蒸汽滅菌 20 min。 培養(yǎng)基 （ 1） MRS 培養(yǎng)基 ： 10g 蛋白胨， 10g 牛肉浸膏， 5g 酵母浸膏， 20g 葡萄糖， 5g 醋酸鈉， 1mL 吐溫 80， 2g 檸檬酸氫二胺， 2g MgSO4 因此，評價微生物酵素的指標主要是以上 3種酶的含量和活力。因此，現(xiàn)在酵素已被廣泛應用于食品 和保健品當中。我國現(xiàn)有益生菌制劑有媽咪愛、促菌生、金雙岐、益菌生、乳康生等品牌。 應用于 奶粉制品 比較多 ， 如 歐美國家 在 發(fā)酵乳飲料和液態(tài)奶 中 添加乳桿菌和雙歧桿菌 。益生菌理論的研究己在國內外進入高潮的同時，益生菌的應用也已形成了強大的產(chǎn)業(yè)。研究表明， 益生菌降低血脂膽固醇水平的作用機制可能包括膽鹽的脫結合 、 膽固醇摻入細胞膜 、 益生菌對膽固醇的吸收 、 菌體對膽固醇的吸附 、 菌體對膽固醇的轉化等。如雙 歧桿菌在動物體內能夠刺激 B 淋巴細胞活化、增殖和分泌抗體，來發(fā)揮體液免疫功能 [31]。若經(jīng)常服用含益生菌的保健食品 ， 有助于恢復正常的腸道 pH 值和腸道菌群的平衡， 可 預防或緩解腹瀉癥狀 [29]。優(yōu)良酵母菌 的 特性 為 [23]：發(fā)酵前期繁殖速度快 、 發(fā)酵產(chǎn)酒精能力強 、 有一定的后繁殖能力 、能產(chǎn)生較好較多的香味物質 、 生理耐性好 等 [24]。大體上益生菌可分為乳酸菌、酵母菌和霉菌 3大類。 福州大學至誠學院本科生畢業(yè)設計 (論文 ) 2 益生菌的來源 益生菌的來源相當廣泛 ， 新鮮的 果蔬 中 、 人體糞便 、 母乳 、 發(fā)酵乳制品、傳統(tǒng)發(fā)酵植物食品 等都存在益生菌 。 1965年被 Lilley和 Stillwell 闡述為 ―由一種微生物分泌的刺激其他微生物生長的物質或組織提取物 ‖。微生物對無菌動物的感染 比較 敏感 [6]，因為 其免疫系統(tǒng)低下和缺乏 ―競爭性定植 ‖。并將 L4 進行分子生物學和生理生化鑒定為嗜熱鏈球菌種。 論文作者簽名： 指導教師簽名： 日期： I 益生菌的篩選 中文摘要 益生菌是一類對宿主有益的活性微生物。 特此聲明。研究結果如下： （ 1）以 酸奶、酒、酒曲和自制酵素為樣品篩選益生菌，把樣品稀釋分別涂布于 MRS、PDA和孟加拉紅培養(yǎng)基上富集、分離，初步篩得 42株菌，并編號保藏。其有著重要的理論定義和廣泛的生理作用，目前有許多關于益生菌的報道 [34]。微生物的某些代謝產(chǎn)物可具有致癌的活性， 積累過多可能 導致癌癥 [7]；體內微生物菌相 平衡 遭到破壞 時，會使某些有害菌 轉為優(yōu)勢菌，引起自體感染 [910]。但益生菌的作用機理在理論上還不夠成熟，目前主要有 3 種學說 :① 優(yōu)勢種群學說 。 益生菌的特征 益生菌有一些共同的特征，并非所有益生菌都必須具備所有特點，但其應盡量多地滿足以下特征，為益 生菌鑒定環(huán)節(jié)提供很好的標準 [1518]。我國發(fā)酵劑中使用的乳酸菌有保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球 菌、嗜酸乳桿菌、兩歧雙歧桿菌 等，在生產(chǎn)中最常用的是保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的混合菌種純培養(yǎng)發(fā)酵劑 [2122]。 在許多產(chǎn)品生產(chǎn)過程中，霉菌起著非常重要的作用。研究表明 ， 益生菌可以通過刺激腸道內的免疫機能，將過低或過高的免疫活性調節(jié)到正常狀態(tài)[30]。Kanagawa 等從啤酒酵母和瑞士乳酸桿菌發(fā)酵乳中分離的三肽物質具有抑制血管緊 張素轉移酶活性的作用 [35]。李新紅 [38]等在健康成體獐的基礎口糧中添加了復合酶和益生菌制劑進行消化代謝試驗，發(fā)現(xiàn)添加復合酶和益生菌后，能夠顯著提高獐對糧食中粗蛋自、粗纖維和礦物質 等 營養(yǎng)物質的利用率。 益生菌酸奶 益生菌酸奶是以益生菌為主要菌種所生產(chǎn)的發(fā)酵乳。 益生菌保健品 保健品是用益生菌配合其他物質制成的，主要包括益生菌保健食品和益生菌藥品。體內酵素含量和活性的高低，影響著人體的病變和衰老。蛋白酶能催化蛋白質水解，在人體中的主要作用是分解食物中蛋白質和 死亡的細胞，促進營養(yǎng)物質的吸收， 有 美容效果。 (4)應用初探：測定初篩菌株的蛋白酶活 力 ，得酶活高的乳酸菌和酵母菌，參考徐祖炎[45]的專利制成酵素，探究其蛋白酶活力的變化。 121℃高壓蒸汽滅菌 20 min。 A、 B 溶液混合，用濾紙過濾后即可使用。 先 將棉藍溶于蒸餾水中，再加入其他成分，微加熱溶解，冷卻 備 用。 （ 2）將所篩菌株編號保藏。通用引物序列如下： 正向引物 27F： 5’AgAgTTTgATCMTggCTCAg3’ 反向引物 1492R： 5’ TACggYTACgTTACgACTT3’ ② 按表 23 所示的體系添加試劑混勻并排氣泡； ③ 運行 PCR，其反應程序為： Step 1 95℃ 預變性 5 min； Step 2 95℃ 變性 30 s； Step 3 55℃ 退火 30s； Step 4 72℃ 延伸 90 s； Step 5 重復 Step 2 至 Step 4，循環(huán)運行 30 次； Step 6 72℃ 延伸 7min； Step 7 4℃ 保存。 （ 2）實驗組按（ 1）制得酵素；對照組，酵素中不加菌，其他不變。 福州大學至誠學院本科生畢業(yè)設計 (論文 ) 16 菌株蛋白酶活力的測定 賴氨酸標準曲線的制作 如表 22 所示，用吸光光度法測得 570nm處各試管中標準賴氨酸的吸光值，制得標準曲線為： y=+（式中： x 為氨基酸質量， μg； y 為吸光值。霉菌有 5 類： M M7 和 M12 菌株形態(tài)相同； M3 和 M4 類似； M M M MM9 和 M10 類似； M13 和 M14 類似； M11 形態(tài)特征不同于其他菌株。 表 33 菌株 L4 糖發(fā)酵實驗結果 菌株編號 糖源 葡萄糖 蔗糖 麥芽糖 α乳糖 D半乳糖 L4 + + — + + ―+‖表示產(chǎn)酸產(chǎn)氣，為陽性； ―－ ‖表示不變，為陰性。并將 L4 進行分子生物學和生理生化鑒定為嗜熱鏈球菌種。 通過進一步研究使益生菌在產(chǎn)品中的應用更加廣泛。菌株再次分離純化后，結合菌落觀察和菌體顯微鏡觀察，復篩出了 18類 形態(tài)特征各不相同的菌，其中有 2類 乳酸菌， 11類 酵母菌， 5類 霉菌。本實驗對菌株 L4 進行糖發(fā)酵實驗，糖源為葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、 α乳糖和 D半乳糖。 初步判定乳酸菌可分為 2 類： L L4 和 L5 為鏈球菌； L L3 和 L6～ L10 為乳桿菌，菌落呈乳白色，菌體圓球形、鏈狀。 a 乳酸菌菌落形態(tài) b 酵母菌菌落形態(tài) c 霉菌菌落形態(tài) 圖 31 103梯度的菌落形態(tài) 復篩 用平板劃線法純化出 18 類形態(tài)特征各不相同的菌株， 2 類乳酸菌， 11 類酵母菌， 5 類霉菌。觀察記錄現(xiàn)象，產(chǎn)酸產(chǎn)氣（ 由紫變黃） 用 ―+‖表示，為陽性；無變化用 ―－ ‖表示，為陰性。 菌株分子生物學鑒定 基因組 DNA 提取 → 電泳驗證 →PCR→ 電泳 → 割膠回收 →T 載體連接、制備感受態(tài)→ 轉化 → 菌液 PCR→ 電泳驗證 → 測序 → 序列分析 （ 1）細菌 DNA 提?。翰捎迷噭┖蟹ǎ凑赵噭┖械牟襟E提取。 （ 10） 10g/L 酪蛋白溶液：酪素 ，精確至 ， 少量 ，加入 磷酸氫二鈉 –磷酸二氫鈉緩沖液 80mL， 在沸水中邊加熱邊攪拌 溶解，冷卻定容到100mL， 4℃ 保存。 A、 B 溶液混合，可稀釋使用 。 主要試劑 （ 1）草酸銨結晶紫染液 溶液 A:結晶紫 2g； 95%酒精 20mL。 121℃ 高壓蒸汽滅菌 20 min。 (2)復篩：對初篩得到的菌株 進一步分離純化。 評價微生物酵素的指標 微生物酵素 含有豐富的酶、維生素、礦物質和次生代謝產(chǎn)物 等 。酵素可催化生物體內幾乎所有的生理生化反應。 美國威斯康星大學的學生 為 Mamp。益生菌 較多應用于 發(fā)酵乳制益生菌的篩選 5 品 。 產(chǎn)生重要的營養(yǎng)物質 益生菌能產(chǎn)生維生素、短鏈脂肪酸、氨基酸等，對骨骼成長和心臟健康起重要 作用。益生菌還能吸附腸內的膽汁酸，增強膽固醇轉化成膽汁酸，從而減輕血清中膽固醇的含量 [34]。如嗜酸乳桿菌可分泌乳糖酶，分解乳糖，從而緩解乳糖不耐癥。其菌落一般較大，菌絲呈長管、分枝狀，無橫隔壁，具多個細胞 核，并會聚成菌絲體。 乳酸菌 乳酸菌（ Lactic acid bacteria），是一類通過發(fā)酵糖類獲得能量，從而產(chǎn)生大量乳酸的 無芽孢、革蘭氏 陽性細菌的總稱，包括乳桿菌和乳鏈菌 [20]。因為嬰兒出生時腸道實際上是無菌的，人體腸道菌群的來源具有很大的不確定性。隨著對益生菌研究的深入， 益生菌的含義日趨完善，其定義也屢次被修訂，益生菌數(shù)量及保健功效方面也都得到進一步豐實 [14]。利是微生物 的某些代謝產(chǎn)物可為人體提供一定能量， 可以 促進礦物質的吸收和代謝途徑；人體內的微生物可以抵制 病原體，防止疾病 [68]。 關鍵詞：益生菌，篩選，乳酸菌，酵母菌，霉菌，鑒定，酵素 II Screening of probiotics Abstract Probiotics is a kind of beneficial microanisms to its host. It is the generic terms of beneficial microanism that can produce accurate health benefits, keep microecological balance for its host, as well as other powerful functions in human intestine and reproductive system. There are several beneficial bacterias and fungis in animals: lactic acid bacteria, yeast and some moulds, etc. The most powerful products that we are studying in the world are mainly all kinds of active probiotics posed of microbials that we have mentioned above, which are