【正文】 b Y13 的菌體形態(tài)（ 1000） 圖 313 Y13 的形態(tài)特征 a Y14 的菌落形態(tài) b Y14 的菌體形態(tài)（ 1000） 圖 314 Y14 的形態(tài)特征 a Y15 的菌落形態(tài) b Y15 的菌體形態(tài)（ 1000） 圖 315 Y15 的形態(tài)特征 福州大學(xué)至誠學(xué)院本科生畢業(yè)設(shè)計 (論文 ) 24 a M1 的菌落形態(tài) b M1 的菌體形態(tài)（ 1000） 圖 316 M1 的形態(tài)特征 a M3 的菌落形態(tài) b M3 的菌體形態(tài)（ 1000） 圖 317 M3 的形態(tài)特征 a M6 的菌落形態(tài) b M6 的菌體形態(tài)（ 1000） 圖 318 M6 的形態(tài)特征 益生菌的篩選 25 a M11 的菌落形態(tài) b M11 的菌體形態(tài)（ 1000） 圖 319 M11 的形態(tài)特征 a M14 的菌落形態(tài) b M14 的菌體形 態(tài)（ 1000） 圖 320 M14 的形態(tài)特征 L4 菌株分子生物學(xué)鑒定 圖 321 L4 菌株的凝膠電泳分析 選擇蛋白酶活高的菌株 L4 進行分子生物學(xué)鑒定，它的 16SrDNA經(jīng) PCR擴增到 1300bp，福州大學(xué)至誠學(xué)院本科生畢業(yè)設(shè)計 (論文 ) 26 如圖 321 所示。 益生菌的篩選 15 第 3 章 實驗結(jié)果與討論 益生菌菌株的篩選 初篩 （ 1）用平板稀釋涂布法，從酸奶、酒、酒曲和自制酵素按 101～ 106梯度稀釋涂布，結(jié)果在 101和 102梯度平板菌落長得太過密集，不易分離； 104～ 106梯度平板菌落長得少，甚至不長；而在 103梯度平板上菌落長得最易分辨，如圖 31。 益生菌的復(fù)篩 （ 1）用劃線法 對初篩 的菌株進一步 分離 純化； 乳酸菌 劃線于 MRS 培養(yǎng)基， 37℃ 恒溫封口倒置培養(yǎng) 2 天；霉菌、酵母菌劃線于 PDA培養(yǎng)基 28℃ 恒溫倒置培養(yǎng) 4 天。將碘化鉀溶于少量蒸餾水中后 ， 加入碘使 其 完全溶解， 最后 加蒸餾水 滴定 至 300mL。 福州大學(xué)至誠學(xué)院本科生畢業(yè)設(shè)計 (論文 ) 8 第 2 章 實驗材料與方法 材料與主要設(shè)備 實驗材料 （ 1）蒙牛酸奶； （ 2）福建省三明 市尤 溪縣的酒和酒曲； （ 3）自制酵素 [44]：紅糖：水果：蒸餾水 =1： 3： 10，自然發(fā)酵 6090 天，得棕黃色上清即為 果蔬酵素?；疾≌唧w內(nèi)的酵素代謝往往是紊亂的，應(yīng)適當(dāng)補充特定種類的酵素，可使人體恢復(fù)健康且維持良好的狀態(tài)。 益生菌乳制品 益生菌乳制品指在一般乳制品中添加益生菌 的食品。 已申報具有降低血脂脂膽固醇功能的專利菌株非常多，如： RP32 等 [36]。 益生菌的作用 預(yù)防或緩解腹瀉 據(jù)報道，飲食習(xí)慣不良或服用抗生素會引起腸道菌群失 衡，從而導(dǎo)致腹瀉等癥狀。 益生菌的種類 目前已確認適用于生產(chǎn)的益生菌菌種較少，研究最多的是乳酸菌 [13]。 益生菌的定義 益生菌 (probiotics)，也有譯為 ―益生素、原生菌 ‖等，是 for life——對生命有益。 （ 2）將初篩得到的 42 株菌進行蛋白酶活力的測定，得 乳酸菌、酵母菌和霉菌中酶活力最高的菌株分別是 L Y14 和 M14，酶活為 、 。 論文作者簽名： 日期： 關(guān)于論文使用授權(quán)的說明 本人完全了解福州大學(xué)至誠學(xué)院有關(guān)保留、使 用學(xué)位論文的規(guī)定，即：學(xué)院有權(quán)保留送交論文的印刷本、復(fù)印件和電子版本，允許論文被查閱和借閱；學(xué)院可以公布論文的全部或部分內(nèi)容，可以采用影印、縮印、數(shù)字化或其他復(fù)制手段保存論文。 益生菌 理論 的產(chǎn)生 人體含有大量的微生 物， 定居于人 體的各個部位 [5]。② 菌群屏障學(xué)說 。 益生菌的篩選 3 酵母菌 酵母菌是一種細胞形狀呈圓形、卵圓形、橢圓形或柱形 ，無 性繁殖的 單細胞 真菌 。 益生菌的免疫調(diào)節(jié)作用有助于抗癌與抑制過敏性疾病。 益生菌的應(yīng)用 雙歧桿菌、乳桿菌、大腸桿菌、 蠟樣芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和酵母菌等益生菌是目前應(yīng)用最廣的。我國益生菌制品主要以藥 品形式被大家接受。 脂肪酶是一類水解油脂的酶， 起分解油脂 的作用， 有 減肥、 保健 效果 。 （ 3） 孟加拉紅培養(yǎng)基： 蛋白胨 5g， 葡萄糖 10g，磷酸二氫鉀 1g， MgSO4 （ 5）無水乙醇、蒸餾水 （ 6） DNA 抽提收試劑盒（細菌）、 DNA 膠回收試劑盒、 PCR2MIX、 SolutionⅠ 、PMD18T：生工生物工程（上海）股份有限公司 。 ④ 用 1%瓊脂糖凝膠電泳對 PCR 產(chǎn)額進行電泳、驗證； ⑤ 用 DNA 膠回收試劑盒回收 16SrDNA； 表 23 PCR 反應(yīng)體系組成 試劑 體積（ μL） 模板 1 正向引物 1 反向引物 1 2MIX 10 ddH2O 7 （ 3） T 載體連接 按表 24 體系 16℃ 酶連 4～ 5h： 益生菌的篩選 13 表 24 T 載體連接體系組成 試劑 體積（ μL） 模板 5 SolutionⅠ 5 PMD18T （ 4）感受態(tài)制備 ① 取菌種 DH5α接種于 LB 試管（ 5ML/管）， 37℃ 、 200rpm過夜培養(yǎng)； ② LB 過夜培養(yǎng)試管中的菌液平均分到兩支新 LB 試管中， 37℃ 、 200rpm培養(yǎng) 3h（受菌體應(yīng)在對數(shù)期為宜， OD600=）； ③ 將菌液分裝于 離心管（ 1ML/管），置于 4℃ 冰箱 15min； ④ 常溫， 12021rpm離心 1min； ⑤ 加入 ，用槍輕吸打散后，置于 4℃ 冰箱保存 20min； ⑥ 常溫， 12021 rmp 離心 1min 棄上清； ⑦ 再加入 ，用槍輕吸打置于 4℃ 冰箱 4h后離心，棄上清，制得感受態(tài)。），變化見圖 32。 結(jié)合菌株形態(tài)觀察、分子生物學(xué)鑒定結(jié)果和生理生化實驗，并查《伯杰細菌手冊》 [47]得 L4 為嗜熱鏈球菌種。我認為益生菌待研究方向 可以 是： 對 益生菌的 功能 性 、作用機理及其產(chǎn)生的影響程度 進行研究； 可以 評價益生菌對腸道微生物的數(shù)量和活性的影響； 確立載體對益生菌的影響 ； 提高益生菌分類的可靠性并使之易于分類，提高菌株的性能和活性 等 。 L4 的生理生化實驗 對菌株進行生理生化實驗，并查找相關(guān)手冊可以將菌株鑒定到具體的種。 （ 3）將 10 株乳酸菌分別編號為 L1～ L10， 18 株酵母菌分別編號為 Y1～ Y18， 14 株霉菌編號為 M1～ M14，用 40%甘油對其做了長期保藏 。 菌株鑒定 菌株形態(tài)學(xué)觀察 （ 1） 菌落形態(tài)觀察：將復(fù)篩后的菌株在對應(yīng)的平板上分區(qū)劃線，以獲得單菌落，便于觀察其菌落形態(tài)； 福州大學(xué)至誠學(xué)院本科生畢業(yè)設(shè)計 (論文 ) 12 （ 2）菌體顯微形態(tài)觀察： ① 乳酸菌：革蘭氏染色法； ② 酵母菌：美藍染液水浸片法； ③ 霉菌：直接制片觀察法。 B 液： % KOH l00mL。4H2O， 2g K2HPO4，蒸餾水 1000mL，瓊脂 20g， 2% CaCO3， pH 。因此，酵素已經(jīng)開始應(yīng)用于化妝品行業(yè)。 益生菌谷物制品 益生菌在 80 年代中期前后應(yīng)用于谷物制品，由于其生產(chǎn)較復(fù)雜，所以品種不多。在歐洲所做的雙盲對照試驗證實了益生菌有預(yù)防陰道感染的作用。益生菌可以抑制有害菌在腸道內(nèi)的繁殖和進入血液循環(huán)系統(tǒng)，減少毒素，促進腸道蠕動，從而提高腸道機能，改善排便狀況。此外，還有一些酵母菌，如釀酒酵母菌、布氏酵母菌等，部分霉菌 和非致病性大腸桿菌也可以是益生菌 [19]。 國際營養(yǎng)學(xué) 界 普遍 認可益生菌是一種對人體有益的 菌，它們可直接作為食品添加劑服用， 從而 維持腸道菌叢的平衡 [13]。初步說明 L L14 可以提高酵素中的蛋白酶活力這一指標，對酵素的發(fā)酵有一定的促作進用，可以提高酵素 的功能性。 福州大學(xué)至誠學(xué)院 本科生畢業(yè)設(shè)計（論文） 題 目： 益生菌的篩選 姓 名： 江福萍 學(xué) 號： 211110111 系 別： 生物工程 專 業(yè)： 生物工程 年 級： 2021 級 指導(dǎo)教師： 2021 年 05 月 25 日 獨創(chuàng)性聲明 本畢業(yè)設(shè)計（論文）是我個人在導(dǎo)師指導(dǎo)下 完成 的。 關(guān)鍵詞：益生菌，篩選，乳酸菌，酵母菌，霉菌，鑒定，酵素 II Screening of probiotics Abstract Probiotics is a kind of beneficial microanisms to its host. It is the generic terms of beneficial microanism that can produce accurate health benefits, keep microecological balance for its host, as well as other powerful functions in human intestine and reproductive system. There are several beneficial bacterias and fungis in animals: lactic acid bacteria, yeast and some moulds, etc. The most powerful products that we are studying in the world are mainly all kinds of active probiotics posed of microbials that we have mentioned above, which are widely used in biological engineering, industrial area, agricultural area, food safety and health life areas. In this essay, the enzyme of probiotics is purificated from yogurt, wine and homemade enzyme samples. With the protease activities as an index, enzymes of high quality is selected, and is applicated in enzyme preliminary exploration then. The following are the research results: （ 1） The yogurt, wine, distiller39。隨著對益生菌研究的深入， 益生菌的含義日趨完善，其定義也屢次被修訂，益生菌數(shù)量及保健功效方面也都得到進一步豐實 [14]。 乳酸菌 乳酸菌（ Lactic acid bacteria），是一類通過發(fā)酵糖類獲得能量，從而產(chǎn)生大量乳酸的 無芽孢、革蘭氏 陽性細菌的總稱，包括乳桿菌和乳鏈菌 [20]。如嗜酸乳桿菌可分泌乳糖酶，分解乳糖，從而緩解乳糖不耐癥。 產(chǎn)生重要的營養(yǎng)物質(zhì) 益生菌能產(chǎn)生維生素、短鏈脂肪酸、氨基酸等，對骨骼成長和心臟健康起重要 作用。 美國威斯康星大學(xué)的學(xué)生 為 Mamp。 評價微生物酵素的指標 微生物酵素 含有豐富的酶