【正文】 ...................................................................... 6 研究內(nèi)容 .................................................................................................................. 6 本課題研究的意義 ................................................................................................. 7 第 2 章 實驗材 料與方法 ............................................................................................................... 8 材料與主要設(shè)備 ............................................................................................................... 8 實驗材料 ................................................................................................................. 8 培養(yǎng)基 ..................................................................................................................... 8 主要試劑 ................................................................................................................. 8 主要儀器設(shè)備 ......................................................................................................... 9 實驗方法 ......................................................................................................................... 10 菌株篩選 ............................................................................................................... 10 菌株蛋白酶活力的測定 ........................................................................................ 11 菌株鑒定 ............................................................................................................... 11 菌株作用于酵素中的初探 ............................................................................................. 14 第 3 章 實驗結(jié)果與討論 ............................................................................................................. 15 益生菌菌株的篩選 ......................................................................................................... 15 IV 初篩 ....................................................................................................................... 15 復(fù)篩 ....................................................................................................................... 15 菌株蛋白酶活力的測定 ................................................................................................. 16 賴氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 ........................................................................................ 16 菌株蛋白酶活力的測定 ....................................................................................... 16 菌株鑒定 ......................................................................................................................... 17 菌落形態(tài)及菌體形態(tài)觀察 ................................................................................... 17 L4 菌株分子生物學(xué)鑒定 ....................................................................................... 25 L4 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 ........................................................................................... 26 L4 的生理生化實驗 ............................................................................................... 26 L4 和 Y5 菌株應(yīng)用于酵素的初步探究 .......................................................................... 27 結(jié)論與展望 ................................................................................................................................... 28 結(jié)論 ........................................................................................................................................ 28 展望 ........................................................................................................................................ 28 參考文獻 ....................................................................................................................................... 29 謝辭 ............................................................................................................................................... 33 附錄 1 磷酸氫二鈉 –磷酸二氫鈉緩沖液配制表 ......................................................................... 34 附錄 2 L4 基因序列 ...................................................................................................................... 35 益生菌的篩選 1 第 1 章 緒論 益生菌概述 益生菌與人類的健康有著密切的關(guān)系，是人體的生態(tài)調(diào)節(jié)劑 [1]，可以維持腸道的菌落平衡和抑制病原菌的生長 [2]。其有著重要的理論定義和廣泛的生理作用，目前有許多關(guān)于益生菌的報道 [34]。 益生菌 理論 的產(chǎn)生 人體含有大量的微生 物， 定居于人 體的各個部位 [5]。微生物與宿主之間有著密切的關(guān)系。微生物對無菌動物的感染 比較 敏感 [6]，因為 其免疫系統(tǒng)低下和缺乏 ―競爭性定植 ‖。普通動物與無菌動物之間 存在著許多 差異 ，這 使人們認(rèn)識到微生物 對人 體 的健康有著重要的意義 [7]。 人體內(nèi)共生的微生物對宿主的影響利弊共存。利是微生物 的某些代謝產(chǎn)物可為人體提供一定能量， 可以 促進礦物質(zhì)的吸收和代謝途徑；人體內(nèi)的微生物可以抵制 病原體，防止疾病 [68]。弊是有些微生物可能與宿主之間構(gòu)成病原關(guān)系，引起宿主的 疾病、衰老或死亡。微生物的某些代謝產(chǎn)物可具有致癌的活性， 積累過多可能 導(dǎo)致癌癥 [7]；體內(nèi)微生物菌相 平衡 遭到破壞 時，會使某些有害菌 轉(zhuǎn)為優(yōu)勢菌，引起自體感染 [910]。正是出于對人體微生物作用的認(rèn)識和要對微生物區(qū)系趨利避害的想法，促使了益生菌理論的產(chǎn)生 [11]。 益生菌的定義 益生菌 (probiotics)，也有譯為 ―益生素、原生菌 ‖等，是 for life——對生命有益。 1965年被 Lilley和 Stillwell 闡述為 ―由一種微生物分泌的刺激其他微生物生長的物質(zhì)或組織提取物 ‖。后來 Fuller [15]、 Guarner[12]等 人也提出了差不多的定義。 國際營養(yǎng)學(xué) 界 普遍 認(rèn)可益生菌是一種對人體有益的 菌，它們可直接作為食品添加劑服用， 從而 維持腸道菌叢的平衡 [13]。隨著對益生菌研究的深入， 益生菌的含義日趨完善，其定義也屢次被修訂，益生菌數(shù)量及保健功效方面也都得到進一步豐實 [14]。 益生菌作用基本機理概述 益生菌被攝入宿主腸道后，在復(fù)雜的微生態(tài)環(huán)境中與近 400 種正常菌群匯合，改變生物體內(nèi)的微生物群落，促進宿主的健康。但益生菌的作用機理在理論上還不夠成熟，目前主要有 3 種學(xué)說 :① 優(yōu)勢種群學(xué)說 。② 菌群屏障學(xué)說 。③ 微生物奪氧學(xué)說。 福州大學(xué)至誠學(xué)院本科生畢業(yè)設(shè)計 (論文 ) 2 益生菌的來源 益生菌的來源相當(dāng)廣泛 ， 新鮮的 果蔬 中 、 人體糞便 、 母乳 、 發(fā)酵乳制品、傳統(tǒng)發(fā)酵植物食品 等都存在益生菌 。 但其 主要來源是動物腸道正常生理性菌和非腸道菌。 許多研究人員認(rèn)為，益生菌來源與其特殊的商業(yè)化應(yīng)用有著非常密切的關(guān)系；但 FAO/WHO 專家建議，益生菌特定的生理作用比其來源更加重要。因為嬰兒出生時腸道實際上是無菌的，人體腸道菌群的來源具有很大的不確定性。到現(xiàn)在為止，市場上還未出現(xiàn)基因工程改造的益生菌。 益生菌的特征 益生菌有一些共同的特征，并非所有益生菌都必須具備所有特點，但其應(yīng)盡量多地滿足以下特征，為益 生菌鑒定環(huán)節(jié)提供很好的標(biāo)準(zhǔn) [1518]。其特征如下： ① 源于宿主并對宿主健康有一定的促進作用； ② 能抵抗 人體內(nèi)各種 酶及膽汁 的 消化作用，能 正常生活于胃腸道中； ③ 能 抑制腸內(nèi)病原體 活性； ④ 通過產(chǎn)生細菌素或抗菌的代謝產(chǎn)物等，選擇性的調(diào)節(jié)微生物區(qū)系 的組成 ； ⑤ 是公認(rèn)安全的微生物； ⑥ 準(zhǔn)確識別菌 及其特性， 有己被證明的安全性； ⑦ 其制品按合理劑量服用時能具有臨床有效性； ⑧ 能 是益生菌產(chǎn)品 保持活性和穩(wěn)定性， 同時能用于大量生產(chǎn)并具有經(jīng)濟價值。 益生菌的種類 目前已確認(rèn)適用于生產(chǎn)的益生菌菌種較少，研究最多的是乳酸菌 [13]。大體上益生菌可分為乳酸菌、酵母菌和霉菌 3大類。 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的益生菌分別是雙歧桿菌類：長雙歧桿菌 、短雙歧桿菌 、 嗜熱雙歧桿菌等，乳酸桿菌類：短乳桿菌、保加利亞乳桿菌、嗜酸乳桿菌等，鏈球菌類： 嗜熱鏈球菌屬 等。此外，還有一些酵母菌，如釀酒酵母菌、布氏酵母