【正文】 統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 ........................................................................................... 26 L4 的生理生化實驗 ............................................................................................... 26 L4 和 Y5 菌株應(yīng)用于酵素的初步探究 .......................................................................... 27 結(jié)論與展望 ................................................................................................................................... 28 結(jié)論 ........................................................................................................................................ 28 展望 ........................................................................................................................................ 28 參考文獻(xiàn) ....................................................................................................................................... 29 謝辭 ............................................................................................................................................... 33 附錄 1 磷酸氫二鈉 –磷酸二氫鈉緩沖液配制表 ......................................................................... 34 附錄 2 L4 基因序列 ...................................................................................................................... 35 益生菌的篩選 1 第 1 章 緒論 益生菌概述 益生菌與人類的健康有著密切的關(guān)系，是人體的生態(tài)調(diào)節(jié)劑 [1]，可以維持腸道的菌落平衡和抑制病原菌的生長 [2]。微生物對無菌動物的感染 比較 敏感 [6]，因為 其免疫系統(tǒng)低下和缺乏 ―競爭性定植 ‖。弊是有些微生物可能與宿主之間構(gòu)成病原關(guān)系，引起宿主的 疾病、衰老或死亡。 1965年被 Lilley和 Stillwell 闡述為 ―由一種微生物分泌的刺激其他微生物生長的物質(zhì)或組織提取物 ‖。 益生菌作用基本機(jī)理概述 益生菌被攝入宿主腸道后，在復(fù)雜的微生態(tài)環(huán)境中與近 400 種正常菌群匯合，改變生物體內(nèi)的微生物群落，促進(jìn)宿主的健康。 福州大學(xué)至誠學(xué)院本科生畢業(yè)設(shè)計 (論文 ) 2 益生菌的來源 益生菌的來源相當(dāng)廣泛 ， 新鮮的 果蔬 中 、 人體糞便 、 母乳 、 發(fā)酵乳制品、傳統(tǒng)發(fā)酵植物食品 等都存在益生菌 。到現(xiàn)在為止，市場上還未出現(xiàn)基因工程改造的益生菌。大體上益生菌可分為乳酸菌、酵母菌和霉菌 3大類。 乳酸菌可用于制造酸奶、乳酪、酒、 腌漬食品 等 。優(yōu)良酵母菌 的 特性 為 [23]：發(fā)酵前期繁殖速度快 、 發(fā)酵產(chǎn)酒精能力強(qiáng) 、 有一定的后繁殖能力 、能產(chǎn)生較好較多的香味物質(zhì) 、 生理耐性好 等 [24]。霉菌通 常用孢子的顏色來稱呼，如黑霉菌 或 紅霉菌 。若經(jīng)常服用含益生菌的保健食品 ， 有助于恢復(fù)正常的腸道 pH 值和腸道菌群的平衡， 可 預(yù)防或緩解腹瀉癥狀 [29]。 增強(qiáng)人體免疫功能 腸道內(nèi)存在非常發(fā)達(dá)的免疫系統(tǒng)，但 人體的免疫功能會隨著年齡的增長而降低。如雙 歧桿菌在動物體內(nèi)能夠刺激 B 淋巴細(xì)胞活化、增殖和分泌抗體，來發(fā)揮體液免疫功能 [31]。 Kawase 等研究證實，乳酸菌屬和鏈球菌屬的發(fā)酵產(chǎn)物能降低血液中總膽固醇水平，增加高密度脂蛋白水平。研究表明， 益生菌降低血脂膽固醇水平的作用機(jī)制可能包括膽鹽的脫結(jié)合 、 膽固醇摻入細(xì)胞膜 、 益生菌對膽固醇的吸收 、 菌體對膽固醇的吸附 、 菌體對膽固醇的轉(zhuǎn)化等。益生菌 可分解脂肪、蛋自質(zhì)和糖，有利于消化吸收 [37]。益生菌理論的研究己在國內(nèi)外進(jìn)入高潮的同時，益生菌的應(yīng)用也已形成了強(qiáng)大的產(chǎn)業(yè)。另外在一些面包、餅干等食品中也有添加。 應(yīng)用于 奶粉制品 比較多 ， 如 歐美國家 在 發(fā)酵乳飲料和液態(tài)奶 中 添加乳桿菌和雙歧桿菌 。M 公司開發(fā)了一種 松脆曲奇 ，里面加有 長雙岐桿菌和嗜酸乳桿菌等益生菌的 [41]。我國現(xiàn)有益生菌制劑有媽咪愛、促菌生、金雙岐、益菌生、乳康生等品牌。人體的能量攝取、新陳代謝、成長和繁殖等生命現(xiàn)象，都必須通過酵素的幫助才能完成。因此，現(xiàn)在酵素已被廣泛應(yīng)用于食品 和保健品當(dāng)中。微生物酵素中的功效酶有蛋白酶、脂肪酶和超氧化物歧化酶等。 因此，評價微生物酵素的指標(biāo)主要是以上 3種酶的含量和活力。 (3)菌種鑒定：菌株形態(tài)學(xué)觀察、分子生物學(xué)鑒定、生理生化鑒定。 培養(yǎng)基 （ 1） MRS 培養(yǎng)基 ： 10g 蛋白胨， 10g 牛肉浸膏， 5g 酵母浸膏， 20g 葡萄糖， 5g 醋酸鈉， 1mL 吐溫 80， 2g 檸檬酸氫二胺， 2g MgSO4 （ 2） PDA 培養(yǎng)基 ： 馬鈴薯 200g，葡萄糖 20 g，蒸餾水 1000 mL，瓊脂 20 g。 121℃ 高壓蒸汽滅菌 20 min。 溶液 B：草酸銨 ；蒸餾水 80mL。配成后貯于棕色瓶內(nèi)備用 。 （ 4）乳酸石灰酸棉藍(lán)染色液： 石炭酸 (結(jié)晶酚 ) 20g，乳酸 20mL，甘油 40mL，棉藍(lán) ，蒸餾水 20mL。 （ 8） 100μg/mL賴氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液： 稱取于 105℃ 干燥冷卻后的賴氨酸 ，用 1moL/L 鹽酸 60mL 溶解后定容至100mL，即為 1mg/mL 賴氨酸標(biāo)準(zhǔn)液。 主要儀器設(shè)備 本課題實驗過程中用到的主要儀器和設(shè)備見表 21： 表 21 主要儀器和設(shè)備說明表 儀器名稱 儀器型號 生產(chǎn)廠家 潔凈工作臺 SWCJ2FD 型 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠 生化培養(yǎng)箱 LRH190 型 廣東省醫(yī)療器械廠 電子天平 ISO 9001 型 賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司 恒溫磁力加熱攪拌器 852 型 上海江星儀器有限公司 pH 計 UB7 型 DENVER INSTRUMENT 公司 移液槍 20~200 μL， 100~1000 μL DREGON LAB 電磁爐 C20SH 2050 型 美的股份有限公司 微波爐 MM823ESJPA 型 美的股份有限公司 福州大學(xué)至誠學(xué)院本科生畢業(yè)設(shè)計 (論文 ) 10 續(xù)表 21 儀器名稱 儀器型號 生產(chǎn)廠家 數(shù)顯恒溫水浴鍋 HH4 型 國華電器有限公司 立式壓力蒸汽滅菌器 YXQLS 型 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠 電熱鼓風(fēng) 干燥箱 DHG9070A型 上海一恒科學(xué)儀器有限公司 雙目生物顯微鏡 ECLIPSE E100 型 日本尼康株式會社 快速混勻器 SK1 型 國華電器有限公司 紫外可見分光光度計 UV1600 型 上海美普達(dá)儀器有限責(zé)任公司 高速冷凍離心機(jī) CF16RXⅡ 型 日本 HITACHI 公司 振蕩培養(yǎng)箱 QTY70F 型 上海知楚儀器有限公司 臺式高速離心機(jī) TGL16M 型 湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司 電泳儀電源 DYY6C 型 北京市六一儀器廠 瓊脂糖水平電泳槽 DYCP31BN 北京市六一 儀器廠 切膠機(jī) OSE470 型 北京市六一儀器廠 PCR 擴(kuò)增儀 T5A/250V型 eppendorf 超純水機(jī) WPUPLH20 型 四川沃特爾水處理設(shè)備有限公司 實驗方法 菌株篩選 菌株的初篩 （ 1）將酸奶、酒、酒曲和自制酵素 [44]樣品按 101～ 106梯度稀釋后分別涂布于 MRS、PDA、孟加拉紅培養(yǎng)基上倒置培養(yǎng)，富集、分離 純化 出菌株。 益生菌的篩選 11 菌株蛋白酶活力的測定 賴氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 表 22 賴氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線制作表 試劑 試管號 0 1 2 3 4 5 100μg/mL標(biāo)準(zhǔn)氨基酸溶液（ mL） 蒸餾水（ mL） 1%茚三酮溶液（ mL） 570nm 吸光值 0 蛋白酶活力的測定 ① 測定方法（吸光光度法） 試管 A（空白，平行 2 份 ） → 加蒸餾水 1ml（ 80℃ 水浴 10min） → 加酪蛋白 1ml（ 40℃水浴 10min） → 加 1%茚三酮 1ml（ 沸水浴， 15min） → 于 570nm測定 Abs 試管 B（酶試樣，平行 2 份 ） → 酶液 1ml+酪蛋白 1ml（ 40℃ 水浴 10min； 80℃ 水浴 10min）→ 加 1%茚三酮 1ml（ 沸水浴， 15min） → 于 570nm測定 Abs ② 計算公式：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和測得的 y值求出賴氨酸含量 x值。 （ 2） DNA 基因的 PCR 擴(kuò)增 ① 16S rDNA PCR 擴(kuò)增。 （ 6）菌液 PCR ① 挑 取 轉(zhuǎn)化平板中的菌于 LB 液體培養(yǎng)基中， 37℃ 、 200rpm培養(yǎng) 5h，獲得菌液； ② 菌液 PCR 步驟、條件、體 系同（ 2），引物不同； ③ 菌液 PCR 擴(kuò)增，通用驗證引物序列如下： 正向引物 M13F47： 5’CgCCAgggTTTTCCCAgTCACgAC3’ 反向引物 M13R48： 5’ AgCggATAACAATTTCACACAggA3’ （ 7）用 1%瓊脂糖凝膠電泳對菌液 PCR 產(chǎn)額進(jìn)行電泳、驗證后， 將菌液送上海英濰捷基貿(mào)易有限公司進(jìn)行測序。 菌株作用于酵素中的初探 （ 1）參考徐祖炎的專利制作酵素 [45]： 含糖多的水果（蘋果） 40 份，含維生素 C 多 的水果（檸檬） 20 份，含脂肪多的水果（菠蘿） 40 份，清水洗凈加抽煙滅菌 30 分鐘，自然晾干后，將水果粉碎成漿，加入 5 份酵母菌、 8 份白糖和 5 份乳酸菌，于 1019℃ 有氧發(fā)酵。由經(jīng)驗得富集菌株是可直接將樣品稀釋成 103梯度涂布于平板，在樣品量大的情況下可以節(jié)省許多時間。 每類代表性菌株形態(tài)特征如表 32 和圖 33～ 320 所示。乳酸菌中 L4 的蛋白酶活最高，為 ；酵母菌中 Y14 的酶活最高，為 ；霉菌中 M14 酶活最高，為 。酵母菌有 11 類： Y Y Y4 和 Y8 菌株形態(tài)類 特征似 ； Y5 和 Y18 類似； Y10 和 Y16 類似； Y11 和 Y17 類似；其他編號菌株形態(tài)特征各不相同。 L4 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 將 L4經(jīng)過 16SrDNA鑒定，去除載體重新拼接的序列附在附錄 2,將此序列通過 NCBI網(wǎng)站的 BLAST程序進(jìn)行序列同源性搜索，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果如表 33所示。 20 天后測得對照組（不加菌）的蛋白酶活力為 ，實驗組（加 L4 和 Y14）的蛋白酶活力為。 （ 2）將初篩得到的 42 株菌進(jìn)行蛋白酶活力的測定，得乳酸菌、酵母菌和霉菌中酶活力最高的菌株為 L Y14 和 M14，酶活分別是 、 。 展望 結(jié)合 L4 的鑒定結(jié)果，查閱相關(guān)資料，可知 其是益生菌，其 他分離獲得的菌株還待鑒定，很可能 為有益菌， 有些可能會是已發(fā)現(xiàn)的菌株，也有可能出現(xiàn)新的菌株，它們 有廣闊的應(yīng)用前景，是實驗室科研工作上寶貴的資源。 益生菌的篩選 29 參考文獻(xiàn) [1] 王旭明 ， 陳宗澤，袁毅 . 益生菌作用機(jī)理的研究進(jìn)展 [J].吉林農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2021， 27(1)： 5053. 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