【正文】 widely used in biological engineering, industrial area, agricultural area, food safety and health life areas. In this essay, the enzyme of probiotics is purificated from yogurt, wine and homemade enzyme samples. With the protease activities as an index, enzymes of high quality is selected, and is applicated in enzyme preliminary exploration then. The following are the research results: （ 1） The yogurt, wine, distiller39。目 前，國內(nèi)外對各類微生物組成的復(fù)合活性益生菌產(chǎn)品比較多研究，其廣泛應(yīng)用于生物工程、食品安全、工農(nóng)業(yè)以及生命健康領(lǐng)域。 福州大學(xué)至誠學(xué)院 本科生畢業(yè)設(shè)計（論文） 題 目： 益生菌的篩選 姓 名： 江福萍 學(xué) 號： 211110111 系 別： 生物工程 專 業(yè)： 生物工程 年 級： 2021 級 指導(dǎo)教師： 2021 年 05 月 25 日 獨(dú)創(chuàng)性聲明 本畢業(yè)設(shè)計（論文）是我個人在導(dǎo)師指導(dǎo)下 完成 的。動物體內(nèi)的益生菌主要有：乳酸菌、酵母菌、部分霉菌等。初步說明 L L14 可以提高酵素中的蛋白酶活力這一指標(biāo)，對酵素的發(fā)酵有一定的促作進(jìn)用，可以提高酵素 的功能性。 人體內(nèi)共生的微生物對宿主的影響利弊共存。 國際營養(yǎng)學(xué) 界 普遍 認(rèn)可益生菌是一種對人體有益的 菌，它們可直接作為食品添加劑服用， 從而 維持腸道菌叢的平衡 [13]。 許多研究人員認(rèn)為，益生菌來源與其特殊的商業(yè)化應(yīng)用有著非常密切的關(guān)系；但 FAO/WHO 專家建議，益生菌特定的生理作用比其來源更加重要。此外，還有一些酵母菌，如釀酒酵母菌、布氏酵母菌等，部分霉菌 和非致病性大腸桿菌也可以是益生菌 [19]。 霉菌 霉菌是絲狀真菌的通稱。益生菌可以抑制有害菌在腸道內(nèi)的繁殖和進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)，減少毒素，促進(jìn)腸道蠕動，從而提高腸道機(jī)能，改善排便狀況。 降低血脂膽固醇 [32] 益生茵可吸附食物中的膽固醇，促使其排出體外 [33]。在歐洲所做的雙盲對照試驗證實了益生菌有預(yù)防陰道感染的作用。 益生菌食品 益生菌食品指含有存活且有益于人體健康益生菌的食品。 益生菌谷物制品 益生菌在 80 年代中期前后應(yīng)用于谷物制品，由于其生產(chǎn)較復(fù)雜，所以品種不多。 福州大學(xué)至誠學(xué)院本科生畢業(yè)設(shè)計 (論文 ) 6 酵素 酵素的定義、作用及應(yīng)用 酵素 (enzyme)又稱為酶，是產(chǎn)生于生物體中具有催化作用的活性大分子 [42]。因此，酵素已經(jīng)開始應(yīng)用于化妝品行業(yè)。 本課題主要研究的內(nèi)容和意義 研究內(nèi)容 (1)初篩：把酸奶、酒、酒曲和自制酵素 [44]樣品稀釋后分別涂布于 MRS、 PDA、孟加拉紅培養(yǎng)基上倒置培養(yǎng)，富集、分離出乳酸菌、酵母菌和霉菌，并編號保藏。4H2O， 2g K2HPO4，蒸餾水 1000mL，瓊脂 20g， 2% CaCO3， pH 。 （ 5）糖發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基： 麥芽粉：溫?zé)崴?6065℃ ） =1:4， 60℃ 保溫糖化 3 小時，碘液檢查后 4 層紗布過濾， 加 入 雞 蛋白和水各 20mL，調(diào)勻、攪拌煮沸后再用 4 層紗布過濾，濾液 滅菌備用 以上不加瓊脂即為液體培養(yǎng)基，否則為固體培養(yǎng)基。 B 液： % KOH l00mL。 （ 9） 1%茚三酮溶液：茚三酮 1g，加無水乙醇溶解，定容至 100mL。 菌株鑒定 菌株形態(tài)學(xué)觀察 （ 1） 菌落形態(tài)觀察：將復(fù)篩后的菌株在對應(yīng)的平板上分區(qū)劃線，以獲得單菌落，便于觀察其菌落形態(tài)； 福州大學(xué)至誠學(xué)院本科生畢業(yè)設(shè)計 (論文 ) 12 （ 2）菌體顯微形態(tài)觀察： ① 乳酸菌：革蘭氏染色法； ② 酵母菌：美藍(lán)染液水浸片法； ③ 霉菌：直接制片觀察法。 福州大學(xué)至誠學(xué)院本科生畢業(yè)設(shè)計 (論文 ) 14 生理生化實驗（ 糖發(fā)酵實驗） 加入培養(yǎng)液容量 1%的糖 源 和 %溴甲酚紫于糖發(fā)酵 基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，分裝于杜氏發(fā)酵管（ 5mL/支），再在試管內(nèi)加入倒置的小玻璃管一支，每種糖設(shè) 2 個平行，于 121℃ 高壓滅菌 15min；將 100μL菌液分別接入各發(fā)酵管中，以不接種者作為對照，置于 30℃ 下培養(yǎng) 1周。 （ 3）將 10 株乳酸菌分別編號為 L1～ L10， 18 株酵母菌分別編號為 Y1～ Y18， 14 株霉菌編號為 M1～ M14，用 40%甘油對其做了長期保藏 。酸奶中分離得 4 株乳酸菌；酒中分離得 1 株酵母 菌 和 5 株霉菌；酒曲中分離出 9 株霉菌；酵素中分離出 6 株乳酸菌和 17 株酵母菌。 L4 的生理生化實驗 對菌株進(jìn)行生理生化實驗，并查找相關(guān)手冊可以將菌株鑒定到具體的種。 福州大學(xué)至誠學(xué)院本科生畢業(yè)設(shè)計 (論文 ) 28 結(jié)論與展望 結(jié)論 本次實驗從酸奶、酒、酒曲和自制酵素樣品中分離純化出益生菌，以蛋白酶活力為指標(biāo)，篩選出酶活高的菌株，并對其在酵素中的應(yīng)用進(jìn)行初步探究，結(jié)果如下： （ 1） 把樣品稀釋分別涂布于 MRS、 PDA和孟加拉紅培養(yǎng)基上富集、分離，初步篩得42株菌，將其編號保藏。我認(rèn)為益生菌待研究方向 可以 是： 對 益生菌的 功能 性 、作用機(jī)理及其產(chǎn)生的影響程度 進(jìn)行研究； 可以 評價益生菌對腸道微生物的數(shù)量和活性的影響； 確立載體對益生菌的影響 ； 提高益生菌分類的可靠性并使之易于分類，提高菌株的性能和活性 等 。 （ 3）將 L Y14 參考徐祖炎的專利制作成酵素， 20 天后測得實驗組的蛋白酶活力為，對照組的蛋白酶活力為 。 結(jié)合菌株形態(tài)觀察、分子生物學(xué)鑒定結(jié)果和生理生化實驗，并查《伯杰細(xì)菌手冊》 [47]得 L4 為嗜熱鏈球菌種。每類代表性菌株形態(tài)特征如表 32 和圖 33～ 320 所示。），變化見圖 32。 （ 2）發(fā)酵 20 天后測酵素的蛋白酶活力，初步探究所篩菌株在酵素中的應(yīng)用。 ④ 用 1%瓊脂糖凝膠電泳對 PCR 產(chǎn)額進(jìn)行電泳、驗證； ⑤ 用 DNA 膠回收試劑盒回收 16SrDNA； 表 23 PCR 反應(yīng)體系組成 試劑 體積（ μL） 模板 1 正向引物 1 反向引物 1 2MIX 10 ddH2O 7 （ 3） T 載體連接 按表 24 體系 16℃ 酶連 4～ 5h： 益生菌的篩選 13 表 24 T 載體連接體系組成 試劑 體積（ μL） 模板 5 SolutionⅠ 5 PMD18T （ 4）感受態(tài)制備 ① 取菌種 DH5α接種于 LB 試管（ 5ML/管）， 37℃ 、 200rpm過夜培養(yǎng)； ② LB 過夜培養(yǎng)試管中的菌液平均分到兩支新 LB 試管中， 37℃ 、 200rpm培養(yǎng) 3h（受菌體應(yīng)在對數(shù)期為宜， OD600=）； ③ 將菌液分裝于 離心管（ 1ML/管），置于 4℃ 冰箱 15min； ④ 常溫， 12021rpm離心 1min； ⑤ 加入 ，用槍輕吸打散后，置于 4℃ 冰箱保存 20min； ⑥ 常溫， 12021 rmp 離心 1min 棄上清； ⑦ 再加入 ，用槍輕吸打置于 4℃ 冰箱 4h后離心，棄上清，制得感受態(tài)。 挑取 1 環(huán)菌株于相關(guān)的液體培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng) 1 天后，按菌液： 40%甘油 =1:1 的比例分裝 于滅菌冷凍管中，先放在 4℃ 冰箱放置 1 天，后放 于 20℃長期保藏。 （ 5）無水乙醇、蒸餾水 （ 6） DNA 抽提收試劑盒（細(xì)菌）、 DNA 膠回收試劑盒、 PCR2MIX、 SolutionⅠ 、PMD18T：生工生物工程（上海）股份有限公司 。 益生菌的篩選 9 （ 2）盧戈氏碘液： 碘 ，碘化鉀 ，蒸餾水 300mL。 （ 3） 孟加拉紅培養(yǎng)基： 蛋白胨 5g， 葡萄糖 10g，磷酸二氫鉀 1g， MgSO4 益生菌的篩選 7 本課題研究的意義 （ 1）研究結(jié)果有助于進(jìn)一步了解 酸奶、酒、酒曲、自制酵素 中微生物的種類； （ 2）對改良酵素生產(chǎn)工藝及設(shè)備，提高產(chǎn)品產(chǎn)量與功能性及技術(shù)創(chuàng)新有重要的參考價值； （ 3）篩選的菌株是實驗室科研工作上寶貴的資源，為進(jìn)一步研究 提供菌種 。 脂肪酶是一類水解油脂的酶， 起分解油脂 的作用， 有 減肥、 保健 效果 。隨著年齡的增大，人體內(nèi)的酵素數(shù)量與活力呈下降趨勢。我國益生菌制品主要以藥 品形式被大家接受。它可緩沖胃液和膽汁的 pH，服用其制成的片劑或膠囊，益生菌更容易通過人體消化道，促進(jìn)健康作用。 益生菌的應(yīng)用 雙歧桿菌、乳桿菌、大腸桿菌、 蠟樣芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和酵母菌等益生菌是目前應(yīng)用最廣的。 大量科學(xué)研究證實酸牛奶中富含益生菌，可降低膽固醇水平，長期補(bǔ)充益生菌還可預(yù)防骨質(zhì)疏松。 益生菌的免疫調(diào)節(jié)作用有助于抗癌與抑制過敏性疾病。霉菌 能產(chǎn)生許多酶類 ，在酒類釀造過程中起糖化作用 [2628]。 益生菌的篩選 3 酵母菌 酵母菌是一種細(xì)胞形狀呈圓形、卵圓形、橢圓形或柱形 ，無 性繁殖的 單細(xì)胞 真菌 。其特征如下： ① 源于宿主并對宿主健康有一定的促進(jìn)作用； ② 能抵抗 人體內(nèi)各種 酶及膽汁 的 消化作用，能 正常生活于胃腸道中； ③ 能 抑制腸內(nèi)病原體 活性； ④ 通過產(chǎn)生細(xì)菌素或抗菌的代謝產(chǎn)物等，選擇性的調(diào)節(jié)微生物區(qū)系 的組成 ； ⑤ 是公認(rèn)安全的微生物； ⑥ 準(zhǔn)確識別菌 及其特性， 有己被證明的安全性； ⑦ 其制品按合理劑量服用時能具有臨床有效性； ⑧ 能 是益生菌產(chǎn)品 保持活性和穩(wěn)定性， 同時能用于大量生產(chǎn)并具有經(jīng)濟(jì)價值。② 菌群屏障學(xué)說 。正是出于對人體微生物作用的認(rèn)識和要對微生物區(qū)系趨利避害的想法，促使了益生菌理論的產(chǎn)生 [11]。 益生菌 理論 的產(chǎn)生 人體含有大量的微生 物， 定居于人 體的各個部位 [5]。將菌株再次分離純化，結(jié)合菌落觀察和菌體顯微鏡觀察，復(fù)篩出了 18類形態(tài)特征各不相同的菌株，其中有 2類乳酸菌， 11類酵 母菌， 5類霉菌。 論文作者簽名： 日期： 關(guān)于論文使用授權(quán)的說明 本人完全了解福州大學(xué)至誠學(xué)院有關(guān)保留、使 用學(xué)位論文的規(guī)定，即：學(xué)院有權(quán)保留送交論文的印刷本、復(fù)印件和電子版本，允許論文被查閱和借閱；學(xué)院可以公布論文的全部或部分內(nèi)容，可以采用影印、縮印、數(shù)字化或其他復(fù)制手段保存論文。保密的論文在解密后應(yīng)遵守此規(guī)定。 （ 2）將初篩得到的 42 株菌進(jìn)行蛋白酶活力的測定，得 乳酸菌、酵母菌和霉菌中酶活力最高的菌株分別是 L Y14 和 M14，酶活為 、 。微生物與宿主之間有著密切的關(guān)系。 益生菌的定義 益生菌 (probiotics)，也有譯為 ―益生素、原生菌 ‖等，是 for life——對生命有益。③ 微生物奪氧學(xué)說。 益生菌的種類 目前已確認(rèn)適用于生產(chǎn)的益生菌菌種較少，研究最多的是乳酸菌 [13]。 主要有釀酒酵母及產(chǎn)脂酵母，酵母菌在酒精發(fā)酵階段 有著 重要角色，為后續(xù)的醋化階段提供底物 —乙醇，但是進(jìn)入釀醋發(fā)酵階段后，數(shù)量則急劇減少，發(fā)酵結(jié)束后，幾乎完全消失。 益生菌的作用 預(yù)防或緩解腹瀉 據(jù)報道，飲食習(xí)慣不良或服用抗生素會引起腸道菌群失 衡，從而導(dǎo)致腹瀉等癥狀。 益生菌對 細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)作用、體液免疫調(diào)節(jié)作用和非特異性免疫調(diào)節(jié)作用 都有一定的福州大學(xué)至誠學(xué)院本科生畢業(yè)設(shè)計 (論文 ) 4 影響 。 已申報具有降低血脂脂膽固醇功能的專利菌株非常多，如： RP32 等 [36]。益生菌 的功效越來越受關(guān)注 ,已在食品工業(yè)特別是發(fā)酵乳品工業(yè)中得到了廣泛 的應(yīng)用 [39]。 益生菌乳制品 益生菌乳制品指在一般乳制品中添加益生菌 的食品。微 生態(tài)調(diào)節(jié)劑 可用于 健康人 ，增進(jìn)健康素質(zhì)，提高健康水平，同時也會產(chǎn)生治療與防病的目的?；疾≌唧w內(nèi)的酵素代謝往往是紊亂的，應(yīng)適當(dāng)補(bǔ)充特定種類的酵素，可使人體恢復(fù)健康且維持良好的狀態(tài)。超氧化物歧化酶 (SOD)是一種特殊 的金屬酶，可以 清除機(jī)體內(nèi)超氧陰離子， 可 防衰老、抗輻射、抗炎和防治腫瘤等 。