【正文】 ................................. 8 主要試劑 ................................................................................................................. 8 主要儀器設(shè)備 ......................................................................................................... 9 實驗方法 ......................................................................................................................... 10 菌株篩選 ............................................................................................................... 10 菌株蛋白酶活力的測定 ........................................................................................ 11 菌株鑒定 ............................................................................................................... 11 菌株作用于酵素中的初探 ............................................................................................. 14 第 3 章 實驗結(jié)果與討論 ............................................................................................................. 15 益生菌菌株的篩選 ......................................................................................................... 15 IV 初篩 ....................................................................................................................... 15 復(fù)篩 ....................................................................................................................... 15 菌株蛋白酶活力的測定 ................................................................................................. 16 賴氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 ........................................................................................ 16 菌株蛋白酶活力的測定 ....................................................................................... 16 菌株鑒定 ......................................................................................................................... 17 菌落形態(tài)及菌體形態(tài)觀察 ................................................................................... 17 L4 菌株分子生物學(xué)鑒定 ....................................................................................... 25 L4 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 ........................................................................................... 26 L4 的生理生化實驗 ............................................................................................... 26 L4 和 Y5 菌株應(yīng)用于酵素的初步探究 .......................................................................... 27 結(jié)論與展望 ................................................................................................................................... 28 結(jié)論 ........................................................................................................................................ 28 展望 ........................................................................................................................................ 28 參考文獻(xiàn) ....................................................................................................................................... 29 謝辭 ............................................................................................................................................... 33 附錄 1 磷酸氫二鈉 –磷酸二氫鈉緩沖液配制表 ......................................................................... 34 附錄 2 L4 基因序列 ...................................................................................................................... 35 益生菌的篩選 1 第 1 章 緒論 益生菌概述 益生菌與人類的健康有著密切的關(guān)系，是人體的生態(tài)調(diào)節(jié)劑 [1]，可以維持腸道的菌落平衡和抑制病原菌的生長 [2]。弊是有些微生物可能與宿主之間構(gòu)成病原關(guān)系，引起宿主的 疾病、衰老或死亡。 益生菌作用基本機(jī)理概述 益生菌被攝入宿主腸道后，在復(fù)雜的微生態(tài)環(huán)境中與近 400 種正常菌群匯合，改變生物體內(nèi)的微生物群落，促進(jìn)宿主的健康。到現(xiàn)在為止，市場上還未出現(xiàn)基因工程改造的益生菌。 乳酸菌可用于制造酸奶、乳酪、酒、 腌漬食品 等 。霉菌通 常用孢子的顏色來稱呼，如黑霉菌 或 紅霉菌 。 增強(qiáng)人體免疫功能 腸道內(nèi)存在非常發(fā)達(dá)的免疫系統(tǒng)，但 人體的免疫功能會隨著年齡的增長而降低。 Kawase 等研究證實，乳酸菌屬和鏈球菌屬的發(fā)酵產(chǎn)物能降低血液中總膽固醇水平，增加高密度脂蛋白水平。益生菌 可分解脂肪、蛋自質(zhì)和糖，有利于消化吸收 [37]。另外在一些面包、餅干等食品中也有添加。M 公司開發(fā)了一種 松脆曲奇 ，里面加有 長雙岐桿菌和嗜酸乳桿菌等益生菌的 [41]。人體的能量攝取、新陳代謝、成長和繁殖等生命現(xiàn)象，都必須通過酵素的幫助才能完成。微生物酵素中的功效酶有蛋白酶、脂肪酶和超氧化物歧化酶等。 (3)菌種鑒定：菌株形態(tài)學(xué)觀察、分子生物學(xué)鑒定、生理生化鑒定。 （ 2） PDA 培養(yǎng)基 ： 馬鈴薯 200g，葡萄糖 20 g，蒸餾水 1000 mL，瓊脂 20 g。 溶液 B：草酸銨 ；蒸餾水 80mL。 （ 4）乳酸石灰酸棉藍(lán)染色液： 石炭酸 (結(jié)晶酚 ) 20g，乳酸 20mL，甘油 40mL，棉藍(lán) ，蒸餾水 20mL。 主要儀器設(shè)備 本課題實驗過程中用到的主要儀器和設(shè)備見表 21： 表 21 主要儀器和設(shè)備說明表 儀器名稱 儀器型號 生產(chǎn)廠家 潔凈工作臺 SWCJ2FD 型 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠 生化培養(yǎng)箱 LRH190 型 廣東省醫(yī)療器械廠 電子天平 ISO 9001 型 賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司 恒溫磁力加熱攪拌器 852 型 上海江星儀器有限公司 pH 計 UB7 型 DENVER INSTRUMENT 公司 移液槍 20~200 μL， 100~1000 μL DREGON LAB 電磁爐 C20SH 2050 型 美的股份有限公司 微波爐 MM823ESJPA 型 美的股份有限公司 福州大學(xué)至誠學(xué)院本科生畢業(yè)設(shè)計 (論文 ) 10 續(xù)表 21 儀器名稱 儀器型號 生產(chǎn)廠家 數(shù)顯恒溫水浴鍋 HH4 型 國華電器有限公司 立式壓力蒸汽滅菌器 YXQLS 型 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠 電熱鼓風(fēng) 干燥箱 DHG9070A型 上海一恒科學(xué)儀器有限公司 雙目生物顯微鏡 ECLIPSE E100 型 日本尼康株式會社 快速混勻器 SK1 型 國華電器有限公司 紫外可見分光光度計 UV1600 型 上海美普達(dá)儀器有限責(zé)任公司 高速冷凍離心機(jī) CF16RXⅡ 型 日本 HITACHI 公司 振蕩培養(yǎng)箱 QTY70F 型 上海知楚儀器有限公司 臺式高速離心機(jī) TGL16M 型 湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司 電泳儀電源 DYY6C 型 北京市六一儀器廠 瓊脂糖水平電泳槽 DYCP31BN 北京市六一 儀器廠 切膠機(jī) OSE470 型 北京市六一儀器廠 PCR 擴(kuò)增儀 T5A/250V型 eppendorf 超純水機(jī) WPUPLH20 型 四川沃特爾水處理設(shè)備有限公司 實驗方法 菌株篩選 菌株的初篩 （ 1）將酸奶、酒、酒曲和自制酵素 [44]樣品按 101～ 106梯度稀釋后分別涂布于 MRS、PDA、孟加拉紅培養(yǎng)基上倒置培養(yǎng)，富集、分離 純化 出菌株。 （ 2） DNA 基因的 PCR 擴(kuò)增 ① 16S rDNA PCR 擴(kuò)增。 菌株作用于酵素中的初探 （ 1）參考徐祖炎的專利制作酵素 [45]： 含糖多的水果（蘋果） 40 份，含維生素 C 多 的水果（檸檬） 20 份，含脂肪多的水果（菠蘿） 40 份，清水洗凈加抽煙滅菌 30 分鐘，自然晾干后，將水果粉碎成漿，加入 5 份酵母菌、 8 份白糖和 5 份乳酸菌，于 1019℃ 有氧發(fā)酵。 每類代表性菌株形態(tài)特征如表 32 和圖 33～ 320 所示。酵母菌有 11 類： Y Y Y4 和 Y8 菌株形態(tài)類 特征似 ； Y5 和 Y18 類似； Y10 和 Y16 類似； Y11 和 Y17 類似；其他編號菌株形態(tài)特征各不相同。結(jié)果如表 33所示。 （ 2）將初篩得到的 42 株菌進(jìn)行蛋白酶活力的測定，得乳酸菌、酵母菌和霉菌中酶活力最高的菌株為 L Y14 和 M14，酶活分別是 、 。 益生菌的篩選 29 參考文獻(xiàn) [1] 王旭明 ， 陳宗澤，袁毅 . 益生菌作用機(jī)理的研究進(jìn)展 [J].吉林農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2021， 27(1)： 5053. [2] 于微，高學(xué)軍，駱超超，王青竹，盧志勇，喬彬 . 產(chǎn)蛋氨酸益生菌的篩選和鑒定 [J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報， 2021， 41(6)： 122126. [3] 侯成杰，齊沙沙，蘇永紅， 穆海菠 . 益生菌產(chǎn)表面活性劑研究進(jìn)展 [J]. 乳業(yè)科學(xué)與技術(shù)， 2021， 148(3)：145148. [4] 李海燕，韓萍，侯長希，王佳江 .益生菌的功效及其在食品中的應(yīng)用 [J].農(nóng)業(yè)技術(shù)