【正文】 微生物 的某些代謝產(chǎn)物可為人體提供一定能量， 可以 促進(jìn)礦物質(zhì)的吸收和代謝途徑；人體內(nèi)的微生物可以抵制 病原體，防止疾病 [68]。 益生菌的定義 益生菌 (probiotics)，也有譯為 ―益生素、原生菌 ‖等，是 for life——對(duì)生命有益。隨著對(duì)益生菌研究的深入， 益生菌的含義日趨完善，其定義也屢次被修訂，益生菌數(shù)量及保健功效方面也都得到進(jìn)一步豐實(shí) [14]。③ 微生物奪氧學(xué)說(shuō)。因?yàn)閶雰撼錾鷷r(shí)腸道實(shí)際上是無(wú)菌的，人體腸道菌群的來(lái)源具有很大的不確定性。 益生菌的種類 目前已確認(rèn)適用于生產(chǎn)的益生菌菌種較少，研究最多的是乳酸菌 [13]。 乳酸菌 乳酸菌（ Lactic acid bacteria），是一類通過(guò)發(fā)酵糖類獲得能量，從而產(chǎn)生大量乳酸的 無(wú)芽孢、革蘭氏 陽(yáng)性細(xì)菌的總稱，包括乳桿菌和乳鏈菌 [20]。 主要有釀酒酵母及產(chǎn)脂酵母，酵母菌在酒精發(fā)酵階段 有著 重要角色，為后續(xù)的醋化階段提供底物 —乙醇，但是進(jìn)入釀醋發(fā)酵階段后，數(shù)量則急劇減少，發(fā)酵結(jié)束后，幾乎完全消失。其菌落一般較大，菌絲呈長(zhǎng)管、分枝狀，無(wú)橫隔壁，具多個(gè)細(xì)胞 核，并會(huì)聚成菌絲體。 益生菌的作用 預(yù)防或緩解腹瀉 據(jù)報(bào)道，飲食習(xí)慣不良或服用抗生素會(huì)引起腸道菌群失 衡，從而導(dǎo)致腹瀉等癥狀。如嗜酸乳桿菌可分泌乳糖酶，分解乳糖，從而緩解乳糖不耐癥。 益生菌對(duì) 細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)作用、體液免疫調(diào)節(jié)作用和非特異性免疫調(diào)節(jié)作用 都有一定的福州大學(xué)至誠(chéng)學(xué)院本科生畢業(yè)設(shè)計(jì) (論文 ) 4 影響 。益生菌還能吸附腸內(nèi)的膽汁酸，增強(qiáng)膽固醇轉(zhuǎn)化成膽汁酸，從而減輕血清中膽固醇的含量 [34]。 已申報(bào)具有降低血脂脂膽固醇功能的專利菌株非常多，如： RP32 等 [36]。 產(chǎn)生重要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì) 益生菌能產(chǎn)生維生素、短鏈脂肪酸、氨基酸等，對(duì)骨骼成長(zhǎng)和心臟健康起重要 作用。益生菌 的功效越來(lái)越受關(guān)注 ,已在食品工業(yè)特別是發(fā)酵乳品工業(yè)中得到了廣泛 的應(yīng)用 [39]。益生菌 較多應(yīng)用于 發(fā)酵乳制益生菌的篩選 5 品 。 益生菌乳制品 益生菌乳制品指在一般乳制品中添加益生菌 的食品。 美國(guó)威斯康星大學(xué)的學(xué)生 為 Mamp。微 生態(tài)調(diào)節(jié)劑 可用于 健康人 ，增進(jìn)健康素質(zhì)，提高健康水平，同時(shí)也會(huì)產(chǎn)生治療與防病的目的。酵素可催化生物體內(nèi)幾乎所有的生理生化反應(yīng)。患病者體內(nèi)的酵素代謝往往是紊亂的，應(yīng)適當(dāng)補(bǔ)充特定種類的酵素，可使人體恢復(fù)健康且維持良好的狀態(tài)。 評(píng)價(jià)微生物酵素的指標(biāo) 微生物酵素 含有豐富的酶、維生素、礦物質(zhì)和次生代謝產(chǎn)物 等 。超氧化物歧化酶 (SOD)是一種特殊 的金屬酶，可以 清除機(jī)體內(nèi)超氧陰離子， 可 防衰老、抗輻射、抗炎和防治腫瘤等 。 (2)復(fù)篩：對(duì)初篩得到的菌株 進(jìn)一步分離純化。 福州大學(xué)至誠(chéng)學(xué)院本科生畢業(yè)設(shè)計(jì) (論文 ) 8 第 2 章 實(shí)驗(yàn)材料與方法 材料與主要設(shè)備 實(shí)驗(yàn)材料 （ 1）蒙牛酸奶； （ 2）福建省三明 市尤 溪縣的酒和酒曲； （ 3）自制酵素 [44]：紅糖：水果：蒸餾水 =1： 3： 10，自然發(fā)酵 6090 天，得棕黃色上清即為 果蔬酵素。 121℃ 高壓蒸汽滅菌 20 min。7H2O ，瓊脂 20g， 1/3000 孟加拉紅溶液 100mL，蒸餾水 1000mL，氯霉素 。 主要試劑 （ 1）草酸銨結(jié)晶紫染液 溶液 A:結(jié)晶紫 2g； 95%酒精 20mL。將碘化鉀溶于少量蒸餾水中后 ， 加入碘使 其 完全溶解， 最后 加蒸餾水 滴定 至 300mL。 A、 B 溶液混合，可稀釋使用 。 （ 7） 磷酸氫二鈉 –磷酸二氫鈉緩沖液： 配法見附錄 1。 （ 10） 10g/L 酪蛋白溶液：酪素 ，精確至 ， 少量 ，加入 磷酸氫二鈉 –磷酸二氫鈉緩沖液 80mL， 在沸水中邊加熱邊攪拌 溶解，冷卻定容到100mL， 4℃ 保存。 益生菌的復(fù)篩 （ 1）用劃線法 對(duì)初篩 的菌株進(jìn)一步 分離 純化； 乳酸菌 劃線于 MRS 培養(yǎng)基， 37℃ 恒溫封口倒置培養(yǎng) 2 天；霉菌、酵母菌劃線于 PDA培養(yǎng)基 28℃ 恒溫倒置培養(yǎng) 4 天。 菌株分子生物學(xué)鑒定 基因組 DNA 提取 → 電泳驗(yàn)證 →PCR→ 電泳 → 割膠回收 →T 載體連接、制備感受態(tài)→ 轉(zhuǎn)化 → 菌液 PCR→ 電泳驗(yàn)證 → 測(cè)序 → 序列分析 （ 1）細(xì)菌 DNA 提取：采用試劑盒法，按照試劑盒的步驟提取。 （ 5）轉(zhuǎn)化 ① 加入 10μL連接體到感受態(tài)中，于 4℃ 冰塊水溶 30min； ② 42℃ 熱激 90s，放于冰上 3min； ③ 加 1mL 液體 LB， 37℃ 、 130rpm搖 1h后， 3000rpm 離心 5min； ④ 棄 LB 液體，將剩余混勻，加 100μL到 Amp+抗性 LB 平板上涂布； ⑤ 37℃ 倒置過(guò)夜培養(yǎng)。觀察記錄現(xiàn)象，產(chǎn)酸產(chǎn)氣（ 由紫變黃） 用 ―+‖表示，為陽(yáng)性；無(wú)變化用 ―－ ‖表示，為陰性。 益生菌的篩選 15 第 3 章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論 益生菌菌株的篩選 初篩 （ 1）用平板稀釋涂布法，從酸奶、酒、酒曲和自制酵素按 101～ 106梯度稀釋涂布，結(jié)果在 101和 102梯度平板菌落長(zhǎng)得太過(guò)密集，不易分離； 104～ 106梯度平板菌落長(zhǎng)得少，甚至不長(zhǎng)；而在 103梯度平板上菌落長(zhǎng)得最易分辨，如圖 31。 a 乳酸菌菌落形態(tài) b 酵母菌菌落形態(tài) c 霉菌菌落形態(tài) 圖 31 103梯度的菌落形態(tài) 復(fù)篩 用平板劃線法純化出 18 類形態(tài)特征各不相同的菌株， 2 類乳酸菌， 11 類酵母菌， 5 類霉菌。 圖 32 賴氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線 菌株蛋白酶活力的測(cè)定 將復(fù)篩得到的 42 株菌在相應(yīng)的發(fā)酵液中培養(yǎng) 2 天，測(cè)得其蛋白酶活力，由表 31 可知除了 Y M3 沒(méi)有酶活，其他菌株都有。 初步判定乳酸菌可分為 2 類： L L4 和 L5 為鏈球菌； L L3 和 L6～ L10 為乳桿菌，菌落呈乳白色，菌體圓球形、鏈狀。 表 32 獲得的菌株的形態(tài)特征 菌株 來(lái)源 菌落形態(tài) 菌體形態(tài) L3 蒙牛酸奶 菌落圓形，表面光滑，邊緣整齊，乳白色 短桿狀，兩桿相連 福州大學(xué)至誠(chéng)學(xué)院本科生畢業(yè)設(shè)計(jì) (論文 ) 18 續(xù) 表 32 菌株 來(lái)源 菌落形態(tài) 菌體形態(tài) L4 蒙牛 酸奶 菌落圓形，表面光滑，邊緣整齊，乳黃色 圓球形，形成鏈狀 Y1 柿皮、柚子酵素 菌落圓形、 2～ 3cm、微凸起、乳黃色，表面濕潤(rùn)、光滑，邊緣整齊，酒香味 橢圓形，單邊出芽 Y2 柿皮、柚子酵素 菌落圓形、 2～ 3cm、凸起、乳白色，表面濕潤(rùn)、光滑，邊緣整齊，酒香味 ，不易挑取 橢圓形，單邊出芽 Y5 酵素 204 菌落圓形、 1～ 、微凸起、乳黃色，表面濕潤(rùn)、光滑，邊緣整齊，酒香味 卵圓形，單邊出芽 Y6 酵素 204 菌落圓形、 3～ 4cm、 凸起、 微紅色 ， 表面 略顯干燥 ，邊緣不整齊，醬香味 小橢圓形， 單邊出芽 Y7 橙皮酵素 菌落圓形、 1～ 、微凸起、乳黃色，表面濕潤(rùn)、光滑，邊緣整齊，酒香味 橢圓形，單邊出芽 Y9 酵素 205 菌落圓形、 1～ 3cm、微凸起、乳白色，表面濕潤(rùn)、光滑，邊緣整齊，酒香味 小橢圓形，單邊出芽 Y10 酵素 205 菌落圓形、 ～ 5cm、微凸起、乳黃色，表面濕潤(rùn)、光滑，邊緣整齊，醬香味 長(zhǎng)橢圓形，單邊出芽 Y11 酵素 201 菌落圓形、 2～ 6cm、微凸起、乳白色，表面 略顯干燥 ，邊緣整齊，酒香味 橢圓長(zhǎng)棒狀，單邊出芽 Y13 酵素 206 菌落圓形、 1～ 、微凸起、乳白色，表面濕潤(rùn)、光滑，邊緣整齊，酒香味 圓形，單邊出芽 Y14 西瓜皮酵素 菌落圓形、 1～ 、微凸起、紅色，表面濕潤(rùn)、光滑，邊緣整齊，醬香味 橢圓棒狀，單邊出芽 Y15 混皮酵素 菌落圓形、 ～ 5cm、凸起、乳白色，表面干燥，邊緣不整齊，酒香味 長(zhǎng)橢圓形，呈樹枝狀，多邊出芽 M1 酒曲 菌落白色 → 淡黃色 → 黑色，干燥，大而緊密、不易挑取，不透明，反面黃褐色，中心與邊緣顏色不一致 雙層產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)，分生孢子球形，分生孢子頭放射狀，頂囊球形、表面全面可育，可觀察到次生小梗、分生小梗、分生 孢子梗 M3 3 個(gè)月酒 菌落白色 → 土黃色，干燥， 棉絮狀， 大而緊密、不易挑取，不透明，正反面顏色一致，中心與邊緣顏色一致 分生孢子橢球形、壁厚，分生孢子、小梗、梗基、分生孢子梗清晰可見 益生菌的篩選 19 續(xù)表 32 菌株 來(lái)源 菌落形態(tài) 菌體形態(tài) M6 酒曲 菌落白色 → 淡黃色 → 灰黑色，干燥，大而緊密、不易挑取，不透明，反面黃色，中心與邊緣顏色不一致 雙層產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)，分生孢子球形 ，分生孢子頭放射狀，頂囊近球形、表面全面可育，可觀察到次生小梗、分生小梗、分生孢子梗 M11 酒曲 菌落白色 → 淡黃色 → 黃色，干燥，大而緊密、不易挑取，不透明，反面淡黃色，中心與邊緣顏色不一致 雙層產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)，分生孢子球形，分生孢子頭放射狀，頂囊球形、表面全面可育，可觀察到次生小梗、分生小梗、分生孢子梗 M14 3 個(gè)月酒 菌落白色 → 淡黃色 → 草綠色，干燥，大而緊密、不易挑取，不透明，正反面顏色一致，中心與邊緣顏色一致 雙層產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)，分生孢子球形，分生孢子頭放射狀，頂囊球形、表面全面可育，可觀察到次生小梗、分生 小梗、分生孢子梗 a L3 的菌落形態(tài) b L3 的菌體形態(tài)（ 1000） 圖 33 L3 的形態(tài)特征 福州大學(xué)至誠(chéng)學(xué)院本科生畢業(yè)設(shè)計(jì) (論文 ) 20 a L4 的菌落形態(tài) b L4 的菌體形態(tài)（ 1000） 圖 34 L4 的形態(tài)特征 a Y1 的菌落形態(tài) b Y1 的菌體形態(tài)（ 1000） 圖 35 Y1 的形態(tài)特征 a Y2 的菌落形態(tài) b Y2 的菌體形態(tài)（ 1000） 圖 36 Y2 的形態(tài)特征 益生菌的篩選 21 a Y5 的菌落形態(tài) b Y5 的菌體形態(tài)（ 1000） 圖 37 Y5 的形態(tài)特征 a Y6 的菌落形態(tài) b Y6 的菌體形態(tài)（ 1000） 圖 38 Y6 的形態(tài)特征 a Y7 的菌落形態(tài) b Y7 的菌體形態(tài)（ 1000） 圖 39 Y7 的形態(tài)特征 福州大學(xué)至誠(chéng)學(xué)院本科生畢業(yè)設(shè)計(jì) (論文 ) 22 a Y9 的菌落形態(tài) b Y9 的菌體形態(tài)（ 1000） 圖 310 Y9 的形態(tài)特征 a Y10 的菌落形態(tài) b Y10 的菌體形態(tài)（ 1000） 圖 311 Y10 的形態(tài)特征 a Y11 的菌落形態(tài) b Y11 的菌體形態(tài)（ 1000） 圖 312 Y11 的形態(tài)特征 益生菌的篩選 23 a Y13 的菌落形態(tài) b Y13 的菌體形態(tài)（ 1000） 圖 313 Y13 的形態(tài)特征 a Y14 的菌落形態(tài) b Y14 的菌體形態(tài)（ 1000） 圖 314 Y14 的形態(tài)特征 a Y15 的菌落形態(tài) b Y15 的菌體