【正文】 形態(tài)（ 1000） 圖 315 Y15 的形態(tài)特征 福州大學至誠學院本科生畢業(yè)設(shè)計 (論文 ) 24 a M1 的菌落形態(tài) b M1 的菌體形態(tài)（ 1000） 圖 316 M1 的形態(tài)特征 a M3 的菌落形態(tài) b M3 的菌體形態(tài)（ 1000） 圖 317 M3 的形態(tài)特征 a M6 的菌落形態(tài) b M6 的菌體形態(tài)（ 1000） 圖 318 M6 的形態(tài)特征 益生菌的篩選 25 a M11 的菌落形態(tài) b M11 的菌體形態(tài)（ 1000） 圖 319 M11 的形態(tài)特征 a M14 的菌落形態(tài) b M14 的菌體形 態(tài)（ 1000） 圖 320 M14 的形態(tài)特征 L4 菌株分子生物學鑒定 圖 321 L4 菌株的凝膠電泳分析 選擇蛋白酶活高的菌株 L4 進行分子生物學鑒定，它的 16SrDNA經(jīng) PCR擴增到 1300bp，福州大學至誠學院本科生畢業(yè)設(shè)計 (論文 ) 26 如圖 321 所示。本實驗對菌株 L4 進行糖發(fā)酵實驗，糖源為葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、 α乳糖和 D半乳糖。 Uncultured bacterium gene Streptococcus thermophilus strain CIP Streptococcus thermophilus strain ST3 Streptococcus sp. BAB3369 Streptococcus thermophilus strain T1 L4 Streptococcus thermophilus strain Y2 Streptococcus thermophilus strain ATCC 19258 Streptococcus salivarius CCHSS3 Streptococcus salivarius strain GD32 Bacillus sp. 47 67 62 98 益生菌的篩選 27 L4 和 Y5 菌株應(yīng)用于酵素的初步探究 將 蛋白酶活 力 高的乳酸菌 L4 和酵母菌 Y14 參考徐祖炎專利制得酵素。菌株再次分離純化后，結(jié)合菌落觀察和菌體顯微鏡觀察，復(fù)篩出了 18類 形態(tài)特征各不相同的菌，其中有 2類 乳酸菌， 11類 酵母菌， 5類 霉菌。初步說明 L L14 可以提高酵素中的蛋白酶活力這一指標，對酵素的發(fā)酵有一定的促作進用，相比不加菌的情況下可以提高酵素的功能性，為進一步研究提供了方向。 通過進一步研究使益生菌在產(chǎn)品中的應(yīng)用更加廣泛。 隨著益生菌產(chǎn)品的不 斷壯大，益生菌的研究工作還需要進一步深入。并將 L4 進行分子生物學和生理生化鑒定為嗜熱鏈球菌種。初步說明 L Y14 可以提高酵素中的蛋白酶活力這一指標，對酵素的發(fā)酵有一定的促作進用，相比不加菌的情況下可以提高酵素的功能性。 表 33 菌株 L4 糖發(fā)酵實驗結(jié)果 菌株編號 糖源 葡萄糖 蔗糖 麥芽糖 α乳糖 D半乳糖 L4 + + — + + ―+‖表示產(chǎn)酸產(chǎn)氣，為陽性； ―－ ‖表示不變，為陰性。 圖 322 L4 菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹 由 圖 322 可知，菌株 L4 和 Streptococcus thermophilus 處于同一分支，進化距離最近，且二者的相似性達 99%，置信度較高， 結(jié)合菌株形態(tài)特征，判斷 該菌株為鏈球菌屬。霉菌有 5 類： M M7 和 M12 菌株形態(tài)相同； M3 和 M4 類似； M M M MM9 和 M10 類似； M13 和 M14 類似； M11 形態(tài)特征不同于其他菌株。 表 31 復(fù)篩菌株的蛋白酶活力 序號 菌株編號 蛋白酶活 U/mL 序號 菌株編號 蛋白酶活 U/mL 1 L1 22 Y12 2 L2 23 Y13 3 L3 24 Y14 4 L4 25 Y15 5 L5 26 Y16 益生菌的篩選 17 續(xù) 表 31 序號 菌株編號 蛋白酶活 U/mL 序號 菌株編號 蛋白酶活 U/mL 6 L6 27 Y17 7 L7 28 Y18 8 L8 29 M1 9 L9 30 M2 10 L10 31 M3 14 Y4 35 M7 15 Y5 36 M8 16 Y6 37 M9 17 Y7 38 M10 18 Y8 39 M11 19 Y9 40 M12 20 Y10 41 M13 21 Y11 42 M14 菌株鑒定 菌落形態(tài)及菌體形態(tài)觀察 一共分離純化得 42 株菌，其中乳酸菌 10 株，酵母菌 18 株，霉菌 14 株。 福州大學至誠學院本科生畢業(yè)設(shè)計 (論文 ) 16 菌株蛋白酶活力的測定 賴氨酸標準曲線的制作 如表 22 所示，用吸光光度法測得 570nm處各試管中標準賴氨酸的吸光值，制得標準曲線為： y=+（式中： x 為氨基酸質(zhì)量， μg； y 為吸光值。 （ 2）初步篩得 42 株菌，其中乳酸菌 10 株，酵母菌 18 株，霉菌 14 株。 （ 2）實驗組按（ 1）制得酵素；對照組，酵素中不加菌，其他不變。 （ 7） 16S rDNA 序列分析 將測序公司發(fā)回的序列 通過 NCBI 網(wǎng)站 用 BLAST 程序進行序列同源性分析。通用引物序列如下： 正向引物 27F： 5’AgAgTTTgATCMTggCTCAg3’ 反向引物 1492R： 5’ TACggYTACgTTACgACTT3’ ② 按表 23 所示的體系添加試劑混勻并排氣泡； ③ 運行 PCR，其反應(yīng)程序為： Step 1 95℃ 預(yù)變性 5 min； Step 2 95℃ 變性 30 s； Step 3 55℃ 退火 30s； Step 4 72℃ 延伸 90 s； Step 5 重復(fù) Step 2 至 Step 4，循環(huán)運行 30 次； Step 6 72℃ 延伸 7min； Step 7 4℃ 保存。 酶活力 (U/g或 U／ mL)=x﹒ v﹒ n/(t﹒ m) 式中： x為反應(yīng)液中的氨基酸含量； v為反應(yīng)試劑的總體積， 3 mL； n為酶液的稀釋倍數(shù)； t為反應(yīng)時間， 10 min； m為酶質(zhì)量或酶體積， g 或 mL。 （ 2）將所篩菌株編號保藏。吸取 1mg/mL 賴氨酸標準液 10mL，用 酸稀釋定容至 100ml，即為 100μg/mL的賴氨酸標準液。 先 將棉藍溶于蒸餾水中，再加入其他成分，微加熱溶解，冷卻 備 用。 （ 3）呂 氏堿性美藍染色液 : A 液：美藍 ； 95%乙醇 30mL。 A、 B 溶液混合，用濾紙過濾后即可使用。 （ 4） LB 培養(yǎng)基：胰蛋白胨 %， NaCl %，酵母提取物 %，蒸餾水定容，PH 調(diào)至 ， 121℃ 蒸汽滅菌 20min。 121℃高壓蒸汽滅菌 20 min。7H2O， MnSO4 (4)應(yīng)用初探：測定初篩菌株的蛋白酶活 力 ，得酶活高的乳酸菌和酵母菌，參考徐祖炎[45]的專利制成酵素，探究其蛋白酶活力的變化。除此之外還有總酚含量、還原力、 DPPH自由基清除能力 和 ABTS自由基清除能力等都可以作為指標，可以系統(tǒng)的考察微生物酵素的抗氧化活力 [43]。蛋白酶能催化蛋白質(zhì)水解，在人體中的主要作用是分解食物中蛋白質(zhì)和 死亡的細胞，促進營養(yǎng)物質(zhì)的吸收， 有 美容效果。此外，酵素具有分解老化細胞、清潔皮膚、淡化皺紋、消除青春痘、徹底改善肌膚狀況等美容功效，還有去除油脂等減肥作用。體內(nèi)酵素含量和活性的高低，影響著人體的病變和衰老。 益生菌存在的問題 益生菌的作用已被人們接受，其在發(fā)酵食品或食品添加劑有許多的應(yīng)用，但也存在許多有待解決的問題，如 :① 目前已經(jīng)確認的適宜的益生菌菌種不多，僅有乳酸桿菌、鏈球菌、芽抱桿菌、雙歧桿菌及酵母等種屬； ② 一些產(chǎn)品中的益生菌在加工、運輸過程中易失活；③ 有些活菌 難以 經(jīng)受低 PH 值的胃酸、膽汁酸及胰液等的作用，數(shù)量 少， 難以發(fā)揮作用；④ 關(guān)于益生菌在體內(nèi)的作用 機理的還不明確，許多學說相互矛盾。 益生菌保健品 保健品是用益生菌配合其他物質(zhì)制成的，主要包括益生菌保健食品和益生菌藥品。 有研究表明向干酪中添加糞腸球菌， 有保健作用 的同時 ，還 可 改善 其 品質(zhì) [40]。 益生菌酸奶 益生菌酸奶是以益生菌為主要菌種所生產(chǎn)的發(fā)酵乳。目前國內(nèi)外益生菌的應(yīng)用主要有以下幾方面。李新紅 [38]等在健康成體獐的基礎(chǔ)口糧中添加了復(fù)合酶和益生菌制劑進行消化代謝試驗，發(fā)現(xiàn)添加復(fù)合酶和益生菌后，能夠顯著提高獐對糧食中粗蛋自、粗纖維和礦物質(zhì) 等 營養(yǎng)物質(zhì)的利用率。 預(yù)防陰道感染 酸牛奶中的嗜酸乳桿菌可抑制陰道內(nèi)白色念珠菌的繁殖。Kanagawa 等從啤酒酵母和瑞士乳酸桿菌發(fā)酵乳中分離的三肽物質(zhì)具有抑制血管緊 張素轉(zhuǎn)移酶活性的作用 [35]?？茖W研究表明，益生菌對宿主細胞免疫系統(tǒng)具有正面作用如增強抵抗力。研究表明 ， 益生菌可以通過刺激腸道內(nèi)的免疫機能，將過低或過高的免疫活性調(diào)節(jié)到正常狀態(tài)[30]。 促進腸道消化系統(tǒng)健康 許多益生菌可在胃腸道內(nèi)產(chǎn)生消化酶，這些酶 可使 人體更好地消化 食物 及其營養(yǎng)成分。 在許多產(chǎn)品生產(chǎn)過程中，霉菌起著非常重要的作用。分離鑒定酵母菌，可以為研究酵母菌在酵素等產(chǎn)品發(fā)酵過程中的生物特性的研究提供了一定的基礎(chǔ) [25]。我國發(fā)酵劑中使用的乳酸菌有保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球 菌、嗜酸乳桿菌、兩歧雙歧桿菌 等，在生產(chǎn)中最常用的是保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的混合菌種純培養(yǎng)發(fā)酵劑 [2122]。 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的益生菌分別是雙歧桿菌類：長雙歧桿菌 、短雙歧桿菌 、 嗜熱雙歧桿菌等，乳酸桿菌類：短乳桿菌、保加利亞乳桿菌、嗜酸乳桿菌等，鏈球菌類： 嗜熱鏈球菌屬 等。 益生菌的特征 益生菌有一些共同的特征，并非所有益生菌都必須具備所有特點，但其應(yīng)盡量多地滿足以下特征，為益 生菌鑒定環(huán)節(jié)提供很好的標準 [1518]。 但其 主要來源是動物腸道正常生理性菌和非腸道菌。但益生菌的作用機理在理論上還不夠成熟，目前主要有 3 種學說 :① 優(yōu)勢種群學說 。后來 Fuller [15]、 Guarner[12]等 人也提出了差不多的定義。微生物的某些代謝產(chǎn)物可具有致癌的活性， 積累過多可能 導(dǎo)致癌癥 [7]；體內(nèi)微生物菌相 平衡 遭到破壞 時，會使某些有害菌 轉(zhuǎn)為優(yōu)勢菌，引起自體感染 [910]。普通動物與無菌動物之間 存在著許多 差異 ，這 使人們認識到微生物 對人 體 的健康有著重要的意義 [7]。其有著重要的理論定義和廣泛的生理作用，目前有許多關(guān)于益生菌的報道 [34]。 （ 3）將 L Y14 參考徐祖炎的專利制作成酵素， 20 天后測得實驗組的蛋白酶活力為，對照組的蛋白酶活力為 。研究結(jié)果如下： （ 1）以 酸奶、酒、酒曲和自制酵素為樣品篩選益生菌，把樣品稀釋分別涂布于 MRS、PDA和孟加拉紅培養(yǎng)基上富集、分離，初步篩得 42株菌，并編號保藏。它 是 定植于人體腸道、生殖系統(tǒng)內(nèi)，能改善宿主微生態(tài)平衡、發(fā)揮有益作用的活性有益微生物的總稱。 特此聲明。文中引用 他人研究成果的 部分已 在 標注 中 說明 ； 其他同志對本設(shè)計（ 論文 ）的啟發(fā)和貢獻均已在 謝辭 中 體現(xiàn)；其它內(nèi)容及成果為本人獨立 完成 。 論文作者簽名： 指導(dǎo)教師簽名： 日期： I 益生菌的篩選 中文摘要 益生菌是一類對宿主有益的活性微生物。 本論文從酸奶、酒、酒曲和自制酵素樣品中篩選出益生菌，以蛋白酶活力為指標，篩 出酶活高的菌株，并對其在酵素中的應(yīng)用進行初步探究。并將 L4 進行分子生物學和生理生化鑒定為嗜熱鏈球菌種。s yeast and homemade enzyme are took as the sample, then the sample dilution are coated on the red culture medium MRS, PDA and Bangladesh to enrich and be separated, preliminary we got 42 screening isolates, and they are numbered and preserved. After that, strain is purified again and observed with microscope. 18 kinds of morphological