【正文】 究的內(nèi)容和意義 研究內(nèi)容 (1)初篩：把酸奶、酒、酒曲和自制酵素 [44]樣品稀釋后分別涂布于 MRS、 PDA、孟加拉紅培養(yǎng)基上倒置培養(yǎng)，富集、分離出乳酸菌、酵母菌和霉菌，并編號保藏。 (3)菌種鑒定：菌株形態(tài)學(xué)觀察、分子生物學(xué)鑒定、生理生化鑒定。 益生菌的篩選 7 本課題研究的意義 （ 1）研究結(jié)果有助于進(jìn)一步了解 酸奶、酒、酒曲、自制酵素 中微生物的種類； （ 2）對改良酵素生產(chǎn)工藝及設(shè)備，提高產(chǎn)品產(chǎn)量與功能性及技術(shù)創(chuàng)新有重要的參考價值； （ 3）篩選的菌株是實驗室科研工作上寶貴的資源，為進(jìn)一步研究 提供菌種 。 培養(yǎng)基 （ 1） MRS 培養(yǎng)基 ： 10g 蛋白胨， 10g 牛肉浸膏， 5g 酵母浸膏， 20g 葡萄糖， 5g 醋酸鈉， 1mL 吐溫 80， 2g 檸檬酸氫二胺， 2g MgSO44H2O， 2g K2HPO4，蒸餾水 1000mL，瓊脂 20g， 2% CaCO3， pH 。 （ 2） PDA 培養(yǎng)基 ： 馬鈴薯 200g，葡萄糖 20 g，蒸餾水 1000 mL，瓊脂 20 g。 （ 3） 孟加拉紅培養(yǎng)基： 蛋白胨 5g， 葡萄糖 10g，磷酸二氫鉀 1g， MgSO4 121℃ 高壓蒸汽滅菌 20 min。 （ 5）糖發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基： 麥芽粉：溫?zé)崴?6065℃ ） =1:4， 60℃ 保溫糖化 3 小時，碘液檢查后 4 層紗布過濾， 加 入 雞 蛋白和水各 20mL，調(diào)勻、攪拌煮沸后再用 4 層紗布過濾，濾液 滅菌備用 以上不加瓊脂即為液體培養(yǎng)基，否則為固體培養(yǎng)基。 溶液 B：草酸銨 ；蒸餾水 80mL。 益生菌的篩選 9 （ 2）盧戈氏碘液： 碘 ，碘化鉀 ，蒸餾水 300mL。配成后貯于棕色瓶內(nèi)備用 。 B 液： % KOH l00mL。 （ 4）乳酸石灰酸棉藍(lán)染色液： 石炭酸 (結(jié)晶酚 ) 20g，乳酸 20mL，甘油 40mL，棉藍(lán) ，蒸餾水 20mL。 （ 5）無水乙醇、蒸餾水 （ 6） DNA 抽提收試劑盒（細(xì)菌）、 DNA 膠回收試劑盒、 PCR2MIX、 SolutionⅠ 、PMD18T：生工生物工程（上海）股份有限公司 。 （ 8） 100μg/mL賴氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液： 稱取于 105℃ 干燥冷卻后的賴氨酸 ，用 1moL/L 鹽酸 60mL 溶解后定容至100mL，即為 1mg/mL 賴氨酸標(biāo)準(zhǔn)液。 （ 9） 1%茚三酮溶液：茚三酮 1g，加無水乙醇溶解，定容至 100mL。 主要儀器設(shè)備 本課題實驗過程中用到的主要儀器和設(shè)備見表 21： 表 21 主要儀器和設(shè)備說明表 儀器名稱 儀器型號 生產(chǎn)廠家 潔凈工作臺 SWCJ2FD 型 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠 生化培養(yǎng)箱 LRH190 型 廣東省醫(yī)療器械廠 電子天平 ISO 9001 型 賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司 恒溫磁力加熱攪拌器 852 型 上海江星儀器有限公司 pH 計 UB7 型 DENVER INSTRUMENT 公司 移液槍 20~200 μL， 100~1000 μL DREGON LAB 電磁爐 C20SH 2050 型 美的股份有限公司 微波爐 MM823ESJPA 型 美的股份有限公司 福州大學(xué)至誠學(xué)院本科生畢業(yè)設(shè)計 (論文 ) 10 續(xù)表 21 儀器名稱 儀器型號 生產(chǎn)廠家 數(shù)顯恒溫水浴鍋 HH4 型 國華電器有限公司 立式壓力蒸汽滅菌器 YXQLS 型 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠 電熱鼓風(fēng) 干燥箱 DHG9070A型 上海一恒科學(xué)儀器有限公司 雙目生物顯微鏡 ECLIPSE E100 型 日本尼康株式會社 快速混勻器 SK1 型 國華電器有限公司 紫外可見分光光度計 UV1600 型 上海美普達(dá)儀器有限責(zé)任公司 高速冷凍離心機(jī) CF16RXⅡ 型 日本 HITACHI 公司 振蕩培養(yǎng)箱 QTY70F 型 上海知楚儀器有限公司 臺式高速離心機(jī) TGL16M 型 湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司 電泳儀電源 DYY6C 型 北京市六一儀器廠 瓊脂糖水平電泳槽 DYCP31BN 北京市六一 儀器廠 切膠機(jī) OSE470 型 北京市六一儀器廠 PCR 擴(kuò)增儀 T5A/250V型 eppendorf 超純水機(jī) WPUPLH20 型 四川沃特爾水處理設(shè)備有限公司 實驗方法 菌株篩選 菌株的初篩 （ 1）將酸奶、酒、酒曲和自制酵素 [44]樣品按 101～ 106梯度稀釋后分別涂布于 MRS、PDA、孟加拉紅培養(yǎng)基上倒置培養(yǎng)，富集、分離 純化 出菌株。 挑取 1 環(huán)菌株于相關(guān)的液體培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng) 1 天后，按菌液： 40%甘油 =1:1 的比例分裝 于滅菌冷凍管中，先放在 4℃ 冰箱放置 1 天，后放 于 20℃長期保藏。 益生菌的篩選 11 菌株蛋白酶活力的測定 賴氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 表 22 賴氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線制作表 試劑 試管號 0 1 2 3 4 5 100μg/mL標(biāo)準(zhǔn)氨基酸溶液（ mL） 蒸餾水（ mL） 1%茚三酮溶液（ mL） 570nm 吸光值 0 蛋白酶活力的測定 ① 測定方法（吸光光度法） 試管 A（空白，平行 2 份 ） → 加蒸餾水 1ml（ 80℃ 水浴 10min） → 加酪蛋白 1ml（ 40℃水浴 10min） → 加 1%茚三酮 1ml（ 沸水浴， 15min） → 于 570nm測定 Abs 試管 B（酶試樣，平行 2 份 ） → 酶液 1ml+酪蛋白 1ml（ 40℃ 水浴 10min； 80℃ 水浴 10min）→ 加 1%茚三酮 1ml（ 沸水浴， 15min） → 于 570nm測定 Abs ② 計算公式：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和測得的 y值求出賴氨酸含量 x值。 菌株鑒定 菌株形態(tài)學(xué)觀察 （ 1） 菌落形態(tài)觀察：將復(fù)篩后的菌株在對應(yīng)的平板上分區(qū)劃線，以獲得單菌落，便于觀察其菌落形態(tài)； 福州大學(xué)至誠學(xué)院本科生畢業(yè)設(shè)計 (論文 ) 12 （ 2）菌體顯微形態(tài)觀察： ① 乳酸菌：革蘭氏染色法； ② 酵母菌：美藍(lán)染液水浸片法； ③ 霉菌：直接制片觀察法。 （ 2） DNA 基因的 PCR 擴(kuò)增 ① 16S rDNA PCR 擴(kuò)增。 ④ 用 1%瓊脂糖凝膠電泳對 PCR 產(chǎn)額進(jìn)行電泳、驗證； ⑤ 用 DNA 膠回收試劑盒回收 16SrDNA； 表 23 PCR 反應(yīng)體系組成 試劑 體積（ μL） 模板 1 正向引物 1 反向引物 1 2MIX 10 ddH2O 7 （ 3） T 載體連接 按表 24 體系 16℃ 酶連 4～ 5h： 益生菌的篩選 13 表 24 T 載體連接體系組成 試劑 體積（ μL） 模板 5 SolutionⅠ 5 PMD18T （ 4）感受態(tài)制備 ① 取菌種 DH5α接種于 LB 試管（ 5ML/管）， 37℃ 、 200rpm過夜培養(yǎng)； ② LB 過夜培養(yǎng)試管中的菌液平均分到兩支新 LB 試管中， 37℃ 、 200rpm培養(yǎng) 3h（受菌體應(yīng)在對數(shù)期為宜， OD600=）； ③ 將菌液分裝于 離心管（ 1ML/管），置于 4℃ 冰箱 15min； ④ 常溫， 12021rpm離心 1min； ⑤ 加入 ，用槍輕吸打散后，置于 4℃ 冰箱保存 20min； ⑥ 常溫， 12021 rmp 離心 1min 棄上清； ⑦ 再加入 ，用槍輕吸打置于 4℃ 冰箱 4h后離心，棄上清，制得感受態(tài)。 （ 6）菌液 PCR ① 挑 取 轉(zhuǎn)化平板中的菌于 LB 液體培養(yǎng)基中， 37℃ 、 200rpm培養(yǎng) 5h，獲得菌液； ② 菌液 PCR 步驟、條件、體 系同（ 2），引物不同； ③ 菌液 PCR 擴(kuò)增，通用驗證引物序列如下： 正向引物 M13F47： 5’CgCCAgggTTTTCCCAgTCACgAC3’ 反向引物 M13R48： 5’ AgCggATAACAATTTCACACAggA3’ （ 7）用 1%瓊脂糖凝膠電泳對菌液 PCR 產(chǎn)額進(jìn)行電泳、驗證后， 將菌液送上海英濰捷基貿(mào)易有限公司進(jìn)行測序。 福州大學(xué)至誠學(xué)院本科生畢業(yè)設(shè)計 (論文 ) 14 生理生化實驗（ 糖發(fā)酵實驗） 加入培養(yǎng)液容量 1%的糖 源 和 %溴甲酚紫于糖發(fā)酵 基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，分裝于杜氏發(fā)酵管（ 5mL/支），再在試管內(nèi)加入倒置的小玻璃管一支，每種糖設(shè) 2 個平行，于 121℃ 高壓滅菌 15min；將 100μL菌液分別接入各發(fā)酵管中，以不接種者作為對照，置于 30℃ 下培養(yǎng) 1周。 菌株作用于酵素中的初探 （ 1）參考徐祖炎的專利制作酵素 [45]： 含糖多的水果（蘋果） 40 份，含維生素 C 多 的水果（檸檬） 20 份，含脂肪多的水果（菠蘿） 40 份，清水洗凈加抽煙滅菌 30 分鐘，自然晾干后，將水果粉碎成漿，加入 5 份酵母菌、 8 份白糖和 5 份乳酸菌，于 1019℃ 有氧發(fā)酵。 （ 2）發(fā)酵 20 天后測酵素的蛋白酶活力，初步探究所篩菌株在酵素中的應(yīng)用。由經(jīng)驗得富集菌株是可直接將樣品稀釋成 103梯度涂布于平板，在樣品量大的情況下可以節(jié)省許多時間。 （ 3）將 10 株乳酸菌分別編號為 L1～ L10， 18 株酵母菌分別編號為 Y1～ Y18， 14 株霉菌編號為 M1～ M14，用 40%甘油對其做了長期保藏 。 每類代表性菌株形態(tài)特征如表 32 和圖 33～ 320 所示。），變化見圖 32。乳酸菌中 L4 的蛋白酶活最高，為 ；酵母菌中 Y14 的酶活最高，為 ；霉菌中 M14 酶活最高，為 。酸奶中分離得 4 株乳酸菌；酒中分離得 1 株酵母 菌 和 5 株霉菌；酒曲中分離出 9 株霉菌；酵素中分離出 6 株乳酸菌和 17 株酵母菌。酵母菌有 11 類： Y Y Y4 和 Y8 菌株形態(tài)類 特征似 ； Y5 和 Y18 類似； Y10 和 Y16 類似； Y11 和 Y17 類似；其他編號菌株形態(tài)特征各不相同。每類代表性菌株形態(tài)特征如表 32 和圖 33～ 320 所示。 L4 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 將 L4經(jīng)過 16SrDNA鑒定，去除載體重新拼接的序列附在附錄 2,將此序列通過 NCBI網(wǎng)站的 BLAST程序進(jìn)行序列同源性搜索，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。 L4 的生理生化實驗 對菌株進(jìn)行生理生化實驗，并查找相關(guān)手冊可以將菌株鑒定到具體的種。結(jié)果如表 33所示。 結(jié)合菌株形態(tài)觀察、分子生物學(xué)鑒定結(jié)果和生理生化實驗，并查《伯杰細(xì)菌手冊》 [47]得 L4 為嗜熱鏈球菌種。 20 天后測得對照組（不加菌）的蛋白酶活力為 ，實驗組（加 L4 和 Y14）的蛋白酶活力為。 福州大學(xué)至誠學(xué)院本科生畢業(yè)設(shè)計 (論文 ) 28 結(jié)論與展望 結(jié)論 本次實驗從酸奶、酒、酒曲和自制酵素樣品中分離純化出益生菌，以蛋白酶活力為指標(biāo)，篩選出酶活高的菌株，并對其在酵素中的應(yīng)用進(jìn)行初步探究，結(jié)果如下： （ 1） 把樣品稀釋分別涂布于 MRS、 PDA和孟加拉紅培養(yǎng)基上富集、分離，初步篩得42株菌，將其編號保藏。 （ 2）將初篩得到的 42 株菌進(jìn)行蛋白酶活力的測定，得乳酸菌、酵母菌和霉菌中酶活力最高的菌株為 L Y14 和 M14，酶活分別是 、 。 （ 3）將 L Y14 參考徐祖炎的專利制作成酵素， 20 天后測得實驗組的蛋白酶活力為，對照組的蛋白酶活力為 。 展望 結(jié)合 L4 的鑒定結(jié)果，查閱相關(guān)資料，可知 其是益生菌，其 他分離獲得的菌株還待鑒定，很可能 為有益菌， 有些可能會是已發(fā)現(xiàn)的菌株，也有可能出現(xiàn)新的菌株，它們 有廣闊的應(yīng)用前景，是實驗室科研工作上寶貴的資源。我認(rèn)為益生菌待研究方向 可以 是： 對 益生菌的 功能 性 、作用機(jī)理及其產(chǎn)生的影響程度 進(jìn)行研究； 可以 評價益生菌對腸道微生物的數(shù)量和活性的影響； 確立載體對益生菌的影響 ； 提高益生菌分類的可靠性并使之易于分類，提高菌株的性能和活性 等 。 益生菌的篩選 29 參考文獻(xiàn) [1] 王旭明 ， 陳宗澤，袁毅 . 益生菌作用機(jī)理的研究進(jìn)展 [J].吉林農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2021， 27(1)： 5053. 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