實(shí)驗(yàn)載體類型與質(zhì)粒dna的提取、分離和純化(編輯修改稿)
2025-06-18 22:43 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 個(gè)環(huán)狀 DNA分子中攜帶一個(gè)抗生素抗性標(biāo)記 ， 一個(gè)來源于大腸桿菌 F因子 (致育因子 )的嚴(yán)緊型控制的復(fù)制子 ， 一個(gè)易于 DNA復(fù)制的由 ATP驅(qū)動的解旋酶 (repE)以及三個(gè)確保低拷貝質(zhì)粒精確分配至子代細(xì)胞的基因座 (para、 parB和 parC)。 將外源基因組 DNA片段在體外連接到約 7kb的 BAC載體上 ， 然后將連接物通過電穿孔的方法導(dǎo)入已鑒定好的大腸桿菌重組缺陷型菌株 ， 就構(gòu)建成了單拷貝的質(zhì)粒 。 第一代 BAC載體不含那些能夠用于區(qū)分?jǐn)y帶重組子的抗生素抗性細(xì)菌菌落與攜帶空載體的細(xì)菌菌落的標(biāo)記物 。 新型的 BAC載體可以通過 。 互補(bǔ)的原理篩選含有插入片段的重組子 ， 并設(shè)計(jì)了位點(diǎn)以利于克隆 DNA的回收和擴(kuò)增 。 BAC與 YAC相似 ， 沒有包裝限制 ， 因此對可接受的基因組 DNA的大小也沒有固定的限制 。 大多數(shù) BAC文庫中克隆的平均大小約 120kb， 然而個(gè)別的 BAC重組子中含有的基因組 DNA最大可達(dá) 300kb。 back 酵母人工染色體 (yeast artificial chromosome， YAC) YAC是結(jié)構(gòu)上能模擬真正酵母染色體的線狀 DNA分子 。 將大片段的基因組 DNA連接到 YAC載體的兩個(gè) “ 臂 ” 上 ， 然后將連接物通過轉(zhuǎn)化的方法導(dǎo)入酵母菌 ， 這樣就構(gòu)成了重組的 YAC。 每一條臂分子中都攜帶一個(gè)選擇記號以及按適當(dāng)方向排列的起端粒作用的 DNA序列 。 另外 ， 其中一條臂上還攜帶著絲粒 DNA序列以及復(fù)制子序列 。 因此在重組的 YAC中 ， 外源基因組 DNA片段的一側(cè)為著絲粒 、 復(fù)制子及選擇標(biāo)記 ， 另一側(cè)為第二種選擇標(biāo)記 。 通過在選擇性瓊脂平板上生長的菌落可鑒定出接受并穩(wěn)定保持人工染色體的酵母轉(zhuǎn)化子 。 目前使用的絕大多數(shù) YAC載體在設(shè)計(jì)上都很容易區(qū)分空載體及含有基因組 DNA插入片段的載體。譬如，一些 YAC載體在其克隆位點(diǎn)插入外源 DNA后，打斷了抑制型 tRNA基因，導(dǎo)致紅色而非白色酵母菌落的形成，這些紅色菌落是由于酵母菌攜帶的 dde2琥珀基因突變所致。由于 YAC沒有包裝壓力限制它們的克隆容量，因此插入片段的平均大小主要取決于基因組 DNA制備的質(zhì)量。大多數(shù) YAC文庫中每一個(gè)克隆含有的外源DNA長度可為 250～ 400kb。而且，大小超過 1Mb的哺乳類基因組 DNA文庫業(yè)已構(gòu)建成功。 back 其它載體類型 穿梭載體 : 真核細(xì)胞 /細(xì)菌質(zhì)粒序列 酵母附加型質(zhì)粒 : 可象質(zhì)粒一樣復(fù)制 , 還可整合進(jìn)染色體 DNA 農(nóng)桿菌 Ti質(zhì)粒 : 植物 葉綠體 DNA: 植物 病
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