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正文內(nèi)容

果蠅精巢fasⅲ基因原核表達載體的構(gòu)建畢業(yè)論文(編輯修改稿)

2024-10-02 10:43 本頁面
 

【文章內(nèi)容簡介】 瓊脂糖凝膠電泳檢測 ( 1)制備 %瓊脂糖凝膠:稱取 瓊脂糖,加入 25ml1 TAE 緩沖液,置微波爐加熱 至完全融化,取出搖勻。 ( 2)膠板的制備: 1) 將塑料內(nèi)槽洗凈、晾干,放置于水平制膠器中,并放好樣品梳; 2) 待膠液冷到 60℃左右時,加入 2— 3μ l 的溴化乙錠,輕輕混勻后將膠液倒入塑料內(nèi)槽,至塑料板上形成一層膠面; 3) 待膠液凝固后,將梳子輕輕垂直拔出; 4) 將塑料內(nèi)槽取出放入電泳槽內(nèi),并加入 1 TAE 緩沖液至電泳槽中使緩沖液浸沒膠面,高出凝膠。 ( 3)加樣:取約 2μ l10 loading buffer 與 2μ l PCR 產(chǎn)物混合均勻,用移液槍加到凝膠孔中,并用 DL15000TM DNA Maker 做對照。 ( 4)電泳:蓋好 電泳槽蓋子,接通電泳槽與電泳儀的電源,選擇電泳電壓 120V,開始電泳。 ( 5)觀察結(jié)果:取出樣品,在紫外燈下觀察,攝像,根據(jù)片段大小判斷目的片段是否擴增成功。 酶切 DNA 產(chǎn)物的純化 產(chǎn)物共 150μ L,集中到 EP 管,加無菌水至 500μ L ( 1)酚抽:在 EP 管中加入等體積,即 500μ L 苯酚 /氯仿混合液,顛倒混勻,室溫 12020r/min 離心 5min,吸取上層液到新的 EP 管,吸約 450μ L ( 2)加入 1/10 體積的 5M NaCl(按 450uL 換算,即 45μ L NaCl) 13 ( 3)加入 23 倍體積無水乙醇 1mL,混勻, 4℃ 12020r/min 離心 10min,吸走上清液,產(chǎn)物沉淀在底部。 ( 4)漂洗:用 70%乙醇清洗沉淀 12 次,離心,徹底吸走上清液。 ( 5)干燥和溶解:自然干燥 5min 至殘留乙醇揮發(fā)干凈,加入 20μ L 無菌水溶解。 酶切,體系如表 所示 表 酶切體系 50μ l Table Enzyme digestion system(50μ l) 反應(yīng)組分 體積 無菌水 l BSA l 10 l BamHI l HindⅢ l 質(zhì)?;蚱? l 溶液配好混勻后瞬時離心,使溶液集中于管底,放在 37℃ 水浴鍋水浴 1h;其中PET28a 質(zhì)粒酶切管在水浴 1h 后需加入 1μ lCIAP,接著水浴 30min。 瓊脂糖凝膠電泳法回收 DNA 制膠 切膠 瓊脂糖凝膠 DNA 回收試劑盒 操作步驟 ( 1)柱平衡步驟:向吸附柱 CA2 中加入 500μ l 平衡液 BL, 12020rpm 離心 1min,倒掉收集管中的廢液,將吸附柱重新放回收集管中。 ( 2)將單一的目的 DNA 條帶從瓊脂糖凝膠中切下,放入干 凈的離心管中,稱取重量。 ( 3)向膠塊中加入 3 倍體積溶膠液 PN, 50℃水浴放置 10min,其間不斷溫和地上下翻轉(zhuǎn)離心管,以確保膠塊充分溶解。 ( 4)將上一步所得的溶液加入一個吸附柱 CA2 中,室溫放置 2min, 12020rpm離心 30sec,倒掉收集管中的廢液,將吸附柱 CA2 放入收集管中。 ( 5)將吸附柱 CA2 中加入 600μ l 漂洗液 PW, 12020rpm 離心 30sec,倒掉收集管中的廢液,將吸附柱 CA2 放入收集管中。 ( 6)重復(fù)操作步驟 5 ( 7)將吸附柱 CA2 放入收集管中, 12020rpm 離心 2min,盡量除 盡漂洗液。將吸附柱 CA2 置于室溫放置數(shù)分鐘,徹底晾干。 ( 8)將吸附柱 CA2 放到一個干凈的離心管中,向吸附膜中間位置懸空滴加適量 14 洗脫緩沖液 EB,室溫放置 2min。 12020rpm 離心 2min 收集 DNA 溶液。 ( 9)電泳檢測:分別取 3μ l 酶切樣品與 2μ l 10 loading buffer 混合后加到凝膠孔中開始電泳,電泳結(jié)束后取出樣品,在紫外燈下觀察,攝像。 DNA 片段的體外連接 (目的基因?qū)胭|(zhì)粒載體 ) 配制連接體系,各成分如表 所示,體系中外源基因量要多些,載體的量要少些; 表 連接體系 10μ l Table Connection system(10μ l) 反應(yīng)組分 體積 10 T4 DNA ligase Buffer l T4 DNA ligase l 酶切的 PET28a 質(zhì)粒 l 酶切的 fasⅢ片段 l 混勻后用瞬時離心,使液體全部集中于管底; 將離心管放于 16℃ 水浴鍋保溫過夜; 取出連接體系,利用感受態(tài)細胞進行轉(zhuǎn)化實驗。 連接體系的轉(zhuǎn)化 取 1 管 100μ l 的 TOP10 超級感受態(tài)細胞 ,在冰上化凍后,在無菌操作臺里向EP 管中加入 7μ l 連接體系,用槍輕輕吹打混勻; 將 EP 管插在冰水復(fù)合物中冰浴 30min; 將 EP 管放到 42℃恒溫水浴鍋中保溫 90s,然后迅速放到冰水復(fù)合物中冰浴2min; 在無菌操作臺里向 EP 管中加入 1ml 的含 K 的液體 LB 培養(yǎng)液,混勻后放于搖床上 37℃振蕩培養(yǎng) 45min,轉(zhuǎn)速為 150rpm/min,使細胞恢復(fù)正常生長狀態(tài); 45min 之后, 3000r/min 離心 3min 在無菌操作臺中棄去 950μ l 上清液,余下的 150μ l 用移液槍輕輕打勻,吸至含 K 的 LB 培養(yǎng)基平板中,用事先已 經(jīng)加熱滅菌并冷卻后的三角推棒輕輕涂布均勻; 待涂布液干燥后,將平板 37℃培養(yǎng)箱中倒置過夜培養(yǎng)。 挑菌落做菌落 PCR PCR 反應(yīng)體系 表 PCR 反應(yīng)體系 25μ l Table PCR reaction system(25μ l) 反應(yīng)組分 體積 10PCR Buffer l 15 dNTP l 上游引物 fasⅢ bamH/F l 下游引物 fasⅢ Hind/R l rTaq 酶 l 模板 ddH2O l 模板:陽性對照 — 重組質(zhì)粒的連接體系 陰性對照 — 無菌水 實驗組 — 待檢測的菌落 PCR 反應(yīng)程序 97℃ 3min 94℃ 30s 30 cycles 52℃ 30s 72℃ 1min 72℃ 3min 16℃ 3min 瓊脂糖凝膠電泳檢測:以 DNA Mamker 和陽性對照作參考,判斷實驗組條帶大小是否正確,進而判斷是否為陽性克隆。 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)管培養(yǎng) 經(jīng)過菌落 PCR 鑒定后,挑選 4 個初步鑒定是陽性克隆的菌落轉(zhuǎn)管培養(yǎng)。 將無菌操作臺滅菌后,取 4 個 15mlEP 管,分別加入約 4ml 含卡那霉素( Kan)的 LB 液體培養(yǎng)基。 用無菌槍頭挑取單菌落,在 EP 管的培養(yǎng)基中輕輕攪拌,并將槍頭打入 EP 管中,蓋緊管蓋,放于搖床上 37℃振蕩培養(yǎng)過夜,轉(zhuǎn)速為 180rpm/min。 PET28afasⅢ質(zhì)粒的少量制備 菌液保種:將選取的菌液擴大培養(yǎng),渾 濁后分別取 450μ l 菌液并各加入 50μ lDMSO 于 20℃凍存。 用質(zhì)粒小提試劑盒(離心柱型)提取并制備質(zhì)粒。 操作步驟: ( 1) 柱平衡步驟:向吸附柱 CP3 中加入 500μ l 平衡液 BL,倒掉收集管中的廢 16 液,將吸附柱重新放回收集管中。 ( 2) 取 過夜培養(yǎng)的菌液,加入離心管中,使用常規(guī)臺式離心機, 12020rpm離心 1min,盡量吸除上清。 ( 3) 向留有菌體沉淀的離心管中加入 250μ l 溶液 P1(使用前已加入 RNaseA) ,用移液槍徹底懸浮細菌沉淀。 ( 4) 向離心管中加入 250μ l 溶液 P2,溫和地上下翻轉(zhuǎn) 68 次使菌體充分裂解,所用時間不超過 5 分鐘。 ( 5) 向離心管中加入 350μ l 溶液 P3,立即溫和地上下翻轉(zhuǎn) 68 次,充分混勻,將出現(xiàn)白色絮狀沉淀。 12020rpm 離心 10min。 ( 6) 將上一步收集的上清液用移液槍轉(zhuǎn)移到吸附柱 CP3 中,盡量不要吸出沉淀。12020rpm 離心 30sec,倒掉收集管中的廢液,將吸附柱 CP3 放入收集管中。 ( 7) 向吸附柱 CP3 中加入 500μ l 去蛋白液 PD, 12020rpm 離心 30sec,倒掉收集管中的廢液,將吸附柱 CP3 重新放回 收集管中。 ( 8) 向吸附柱 CP3 中加入 600μ l 漂洗液 PW, 12020rpm 離心 30sec,倒掉收集管中的廢液,將吸附柱 CP3 放回 收集管中。 ( 9) 重復(fù)操作步驟( 8) ( 10) 將
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