【正文】 做對照。 本實驗選用的 PET28a 為質粒載體，長度為 5369bp 。 果蠅精巢中 fasⅢ 基因主要在 hub cell 中表達 [1]，利用 fasIII 基因的表達蛋白制備多克隆抗體，進行抗原抗體免疫熒光反應，可以確定 Hub 細胞 的位置 [2]，從而有利于對果蠅精巢干細胞的研究。 GSC 有 79 個， 9 位于精巢的頂端，與 Hub cell（ HC） 直接接觸， HC 是精巢 GSC 微環(huán)境的重要組成部分 [4]， SSC 包裹在 GSC 周圍，和 HC 共同構成了 GSC 的“ niche” [5]。 作者簽名： 日期： 年 月 日 導師簽名： 日期： 年 月 日 注 意 事 項 （論文）的內容包括： 1）封面（按教務處制定的標準封面格式制作） 2）原創(chuàng)性聲明 3）中文摘要（ 300 字左右）、關鍵詞 4）外文摘要、關鍵詞 5）目次頁（附件不統(tǒng)一編入） 6）論文主體部分：引言（或緒論）、正文、結論 7）參考文獻 8）致謝 9）附錄（對論文支持必要時） ：理工類設計（論文）正文字數(shù)不少于 1 萬字（不包括圖紙、程序清單等），文科類論文正文字數(shù)不少于 萬字。 作 者 簽 名： 日 期： 指導教師簽名： 日 期： 使用授權說明 本人完全了解 大學關于收集、保存、使用畢業(yè)設計（論文）的規(guī)定，即：按照學校要求提交畢業(yè)設計（論文）的印刷本和電子版本；學校有權保存畢業(yè)設計（論文）的印刷本和電子版，并提供目錄檢索與閱覽服務；學?？梢圆捎糜坝　⒖s印、數(shù)字化或其它復制手段保存論文；在不以贏利為目的前提下，學?？梢怨颊撐牡牟糠只蛉績热?。 作者簽名： 日 期： 學位論文原創(chuàng)性聲明 本人鄭重聲明：所呈交的論文是本人在導師的指導下獨立進行研究所取得的研究成果。 ：任務書、開題報告、外文譯文、譯文原文（復印件）。同卵巢 GSCs 一樣 ,精巢的 GSCs 也通過不對稱分裂產(chǎn)生 2 個子代細胞，一個 仍然處于微環(huán)境中，與 HC 直接接觸，成為新的 GSC，另一個遠離微環(huán)境，發(fā)育為 GB（ gonialblast） 細胞，走向分化。 載體 （ Vectors） 廣義上通常把能攜帶外源基因進入受體細胞的運載工具叫載體。 抗菌素的抗性工作原理 卡那霉素（ kanamycin， Kan）殺菌原理： 通過與 70S 核糖體結合，導致 mRNA 發(fā)生錯讀。 （ 4）電泳：蓋好 電泳槽蓋子，接通電泳槽與電泳儀的電源，選擇電泳電壓 120V，開始電泳。 （ 3）向膠塊中加入 3 倍體積溶膠液 PN， 50℃水浴放置 10min，其間不斷溫和地上下翻轉離心管，以確保膠塊充分溶解。 DNA 片段的體外連接 (目的基因導入質粒載體 ) 配制連接體系，各成分如表 所示，體系中外源基因量要多些，載體的量要少些； 表 連接體系 10μ l Table Connection system(10μ l) 反應組分 體積 10 T4 DNA ligase Buffer l T4 DNA ligase l 酶切的 PET28a 質粒 l 酶切的 fasⅢ片段 l 混勻后用瞬時離心，使液體全部集中于管底； 將離心管放于 16℃ 水浴鍋保溫過夜； 取出連接體系，利用感受態(tài)細胞進行轉化實驗。 操作步驟： （ 1） 柱平衡步驟：向吸附柱 CP3 中加入 500μ l 平衡液 BL，倒掉收集管中的廢 16 液，將吸附柱重新放回收集管中。 （ 7） 向吸附柱 CP3 中加入 500μ l 去蛋白液 PD， 12020rpm 離心 30sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱 CP3 重新放回 收集管中。目的基因 fasⅢ為 950bp,與 Marker 第二條帶（ 1000bp）基本對應。 圖 34 菌落 PCR 的鑒定 The identification of colony PCR 1， 2， 3， 5，菌落 PCR 產(chǎn)物； 4，陽性對照； M， DNA Marker； 質粒制備的鑒定 瓊脂糖凝膠電泳檢測，鑒定結果如下圖 35 所示， 制備目的基因 fasⅢ 與PET28a 的重組質粒，片段大小約 6000bp， 以 DNA Mamker(15000bp)作參考， 位于 Marker 第三條帶（ 5000bp）和第四條帶（ 7500bp）之間。大學生活的結束，意味著我要踏上新的征程，再次揚帆起航。 陳 老師是我的良師，不僅在畢業(yè)論文期間給力我很大的幫助，同時在我考研期間也給了我很多寶貴的意見。 載體 ....................................................................................... 錯誤 !未定義書簽。 實驗方法 ................................................................................. 錯誤 !未定義書簽。 PET28afasⅢ質粒的少量制備 ......................................... 錯誤 !未定義書簽。 重組質粒雙酶切鑒定 ............................................................... 錯誤 !未 定義書簽。 參考文獻 .............................................................................................. 錯誤 !未定義書簽。 三、實驗結果與分析 ............................................................................ 錯誤 !未定義書簽。 酶切 .............................................................................. 錯誤 !未定義書簽。 2 實驗材料與方法 ................................................................................ 錯誤 !未定義書簽。感謝你們的陪伴與幫助，尤其感謝師姐師兄對 我的耐心指導和悉心解說，給予我很大的幫助 ，讓我受益匪淺， 在這里請接受我誠摯的謝意。這次的經(jīng)歷讓我受益匪淺 ， 同時也暴露出我在多方面的不足與缺陷。 1 2 3 M 1 2 3 4 5 M 1000bp 20 圖 35 質粒制備的鑒定 The Identification of plasmid M， DNA Marker； 1,2,3,重組質粒 ； 重組質粒雙酶切鑒定 瓊脂糖凝膠電泳檢測，鑒定結果如下圖 36 所示，雙 酶切后的產(chǎn)物為兩條帶，分別是目的基因 fasⅢ片段與質粒 PET28a 片段，其中目的基因片段與 DNA Marker(15000bp)第一條帶對應，質粒 PET28a 片段與 DNA Marker 第四條帶對應， 1， 2， 3，分別對應 EP 管上編號為 3， 4， 10 圖 36 重組質粒雙酶切鑒定 The rebinant plasmid was identified by double enzyme digestion 1， 2， 3，雙酶切產(chǎn)物； M， DNA Marker； 四、討論 實驗成功構建了果蠅精巢 fasⅢ 基因原核表達載體，最終目的是實現(xiàn) fasⅢ蛋白的原核表達與純化，為以后制備多克隆抗體奠定基礎。 1 2 M 1000bp 18 圖 31 目的基因 fasⅢ的 PCR 鑒定 Identification of PCR gene Fas III 1， 2；目的基因片段 M,DNA Marker； 瓊脂糖凝膠電泳檢測，鑒定結果如下圖 32 所示， 實驗所用 DNA Marker 為15000bp，目的基因 fasⅢ為 950bp，與 Marker 第二條