【正文】 印、數(shù)字化或其它復制手段保存論文；在不以贏利為目的前提下，學校可以公布論文的部分或全部內(nèi)容。 果蠅精巢 fasⅢ 基因原核表達載體的構(gòu)建 畢業(yè)設計（論文）原創(chuàng)性聲明和使用授權(quán)說明 原創(chuàng)性聲明 本人鄭重承諾：所呈交的畢業(yè)設計（論文），是我個人在指導教師的指導下進行的研究工作及取得的成果。 作者簽名： 日 期： 學位論文原創(chuàng)性聲明 本人鄭重聲明：所呈交的論文是本人在導師的指導下獨立進行研究所取得的研究成果。 作者簽名： 日期： 年 月 日 學位論文版權(quán)使用授權(quán)書 本學位論文作者完全了解學校有關(guān)保留、使用學位論文的規(guī)定，同意學校保留并向國家有關(guān)部門或機構(gòu)送交論文的復印件和電子版，允許論 文被查閱和借閱。 ：任務書、開題報告、外文譯文、譯文原文（復印件）。最終目的是實現(xiàn) fasⅢ 蛋白的原核表達與純化，為以后制備多克隆抗體奠定基礎。同卵巢 GSCs 一樣 ,精巢的 GSCs 也通過不對稱分裂產(chǎn)生 2 個子代細胞，一個 仍然處于微環(huán)境中，與 HC 直接接觸，成為新的 GSC，另一個遠離微環(huán)境，發(fā)育為 GB（ gonialblast） 細胞，走向分化。 圖 12 精巢前端的結(jié)構(gòu) The leadingend structure of tesis fasⅢ基因 干細胞研究是目前國際研究前沿的熱點之一，生殖干細胞 GSC 的研究對于干細胞維 持與分化等領域，以及生殖醫(yī)學及其相關(guān)疾病等的治療都將提供有價值的資料。 載體 （ Vectors） 廣義上通常把能攜帶外源基因進入受體細胞的運載工具叫載體。 （ 3） 具有多種單一的核酸酶切位點 (多克隆位點 )，可用于外源基因的插入，同時不影響載體的擴增和繁殖。 抗菌素的抗性工作原理 卡那霉素（ kanamycin， Kan）殺菌原理： 通過與 70S 核糖體結(jié)合，導致 mRNA 發(fā)生錯讀。 引物片段： FasbamH/F： ataggatccCTCCTCAACGAAGGCATCG FasHind/R： ataaagcttctaGAGGCTGCTGCTGGGCGGTTTG 質(zhì)粒載體 本實驗所用質(zhì)粒載體 PET28a 來自于本實驗室保存。 （ 4）電泳：蓋好 電泳槽蓋子，接通電泳槽與電泳儀的電源，選擇電泳電壓 120V，開始電泳。 （ 5）干燥和溶解：自然干燥 5min 至殘留乙醇揮發(fā)干凈，加入 20μ L 無菌水溶解。 （ 3）向膠塊中加入 3 倍體積溶膠液 PN， 50℃水浴放置 10min，其間不斷溫和地上下翻轉(zhuǎn)離心管，以確保膠塊充分溶解。將吸附柱 CA2 置于室溫放置數(shù)分鐘，徹底晾干。 DNA 片段的體外連接 (目的基因?qū)胭|(zhì)粒載體 ) 配制連接體系，各成分如表 所示，體系中外源基因量要多些，載體的量要少些； 表 連接體系 10μ l Table Connection system(10μ l) 反應組分 體積 10 T4 DNA ligase Buffer l T4 DNA ligase l 酶切的 PET28a 質(zhì)粒 l 酶切的 fasⅢ片段 l 混勻后用瞬時離心，使液體全部集中于管底； 將離心管放于 16℃ 水浴鍋保溫過夜； 取出連接體系，利用感受態(tài)細胞進行轉(zhuǎn)化實驗。 將無菌操作臺滅菌后，取 4 個 15mlEP 管，分別加入約 4ml 含卡那霉素（ Kan）的 LB 液體培養(yǎng)基。 操作步驟： （ 1） 柱平衡步驟：向吸附柱 CP3 中加入 500μ l 平衡液 BL，倒掉收集管中的廢 16 液，將吸附柱重新放回收集管中。 （ 5） 向離心管中加入 350μ l 溶液 P3，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn) 68 次，充分混勻，將出現(xiàn)白色絮狀沉淀。 （ 7） 向吸附柱 CP3 中加入 500μ l 去蛋白液 PD， 12020rpm 離心 30sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱 CP3 重新放回 收集管中。 ３、 離心管中收集制備好的質(zhì)粒，進行瓊脂糖凝膠電泳檢測： 分別取 3μ l 提取的質(zhì)粒 DNA 樣品與 2μl 10 loading buffer 混合后加到凝膠孔中開始電泳，電泳結(jié)束后取出樣品，在紫外燈下觀察，攝像， 根據(jù)片段 大小判斷質(zhì)粒是否制備成功。目的基因 fasⅢ為 950bp,與 Marker 第二條帶（ 1000bp）基本對應。 圖 32 目的基因片段與質(zhì)粒酶切反應后鑒定 The identification of target gene fragment and the plasmid 1，目的基因 fasⅢ的酶切結(jié)果； M， DNA Marker； 2，質(zhì)粒 PET28a 酶切結(jié)果； 瓊脂糖凝膠 DNA 回收試劑盒回收 DNA 瓊脂糖凝膠電泳檢測，鑒定結(jié)果如下圖 33 所示， 實驗所用 DNA Marker 為15000bp，目的基因 fasⅢ為 950bp，與 Marker 第二條帶（ 1000bp）基本對應。 圖 34 菌落 PCR 的鑒定 The identification of colony PCR 1， 2， 3， 5，菌落 PCR 產(chǎn)物； 4，陽性對照； M， DNA Marker； 質(zhì)粒制備的鑒定 瓊脂糖凝膠電泳檢測，鑒定結(jié)果如下圖 35 所示， 制備目的基因 fasⅢ 與PET28a 的重組質(zhì)粒，片段大小約 6000bp， 以 DNA Mamker(15000bp)作參考， 位于 Marker 第三條帶（ 5000bp）和第四條帶（ 7500bp）之間。利用 fasⅢ 表達蛋白制備多克隆抗體，可用于抗原抗體免疫熒光反應，從而標記 hub cell 的位置，更 利于了解和研究果蠅精巢結(jié)構(gòu)。大學生活的結(jié)束，意味著我要踏上新的征程，再次揚帆起航。 在論文實驗設計和寫作過程中，我得到了 陳冬生 老師極大地幫助和耐心的指導。 陳 老師是我的良師，不僅在畢業(yè)論文期間給力我很大的幫助，同時在我考研期間也給了我很多寶貴的意見。還有我的爸爸媽媽，姑姑、舅舅對我生活方方面面的關(guān)心，你們是我堅強的后盾，是我溫馨的港灣，愿你們一生平安幸福！ 費紫薇 2020 年 4 月 目錄 摘 要 ................................................................................................. 錯誤 !未定義書簽。 載體 ....................................................................................... 錯誤 !未定義書簽。 實驗儀器 ....................................................................... 錯誤 !未定義書簽。 實驗方法 ................................................................................. 錯誤 !未定義書簽。 DNA 片段的體外連接 (目的基因?qū)胭|(zhì)粒載體 ) ............... 錯誤 !未定義書簽。 PET28afasⅢ質(zhì)粒的少量制備 ......................................... 錯誤 !未定義書簽。 質(zhì)粒和目的基因片段酶切反應 .................................................. 錯誤 !未定義書簽。 重組質(zhì)粒雙酶切鑒定 ............................................................... 錯誤 !未 定義書簽。 。 參考文獻 ....................................................