【文章內容簡介】 相比，固定化細胞表現(xiàn)生長穩(wěn)定，降解能力強的優(yōu)點。 4，處理重金屬廢水 由于微生物經(jīng)固定化后，其穩(wěn)定性增加，抗生物毒性物質的能力也大大增強，因此可以被廣泛地用于各種有機廢水中重金屬離子的去除。 七、基因工程菌的固定化 游離細胞培養(yǎng)過程中出現(xiàn)的質粒高度不穩(wěn)定性可能是由于如下原因：質粒的高拷貝數(shù)對細胞是有害的，并因此使具質粒細胞在與不具質粒細胞的競爭中處于劣勢。而固定化顆粒的物理性能，使得兩種細胞間的競爭被極大地降低。固定化基質中的微小區(qū)室使細胞經(jīng)過有限 次的分裂形成小克隆， Nasri 等人發(fā)現(xiàn)無論接種量如何這些小克隆在釋放到培養(yǎng)液中去之前只能繁殖 10～ 16 代，在此過程中即使出現(xiàn) P細胞，也會由于延遲期的存在使其無法與 P＋ 細胞競爭而占據(jù)培養(yǎng)物中的大多數(shù)。例如將具有 pTG201 和不具 pTG201 的 混合，游離培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn) P＋ 細胞很快消失，而共固定化后的培養(yǎng)則 P＋ 細胞和 P細胞能維持恒定比例達 80 代以上。隨著凝膠顆粒中細胞的生長，凝膠的剛性極大地降低，靠近凝膠顆粒表面的微孔破裂并將其中的細胞釋放出來。因此固定化生長細胞可被看成是一個免受 P細胞競爭的細胞 庫。除了限制細胞分裂次數(shù)外，質?？截悢?shù)的增加也使得質粒的穩(wěn)定性提高， Sayadi 等的實驗表明： (pTG201)固定化培養(yǎng)物中質?？截悢?shù)一直穩(wěn)定在 250 左右。電鏡照片顯示固定化細胞間存在緊密接觸，似乎有可能由于質粒的轉移而提高了工程菌的穩(wěn)定性，通過將 和 細胞共固定化并培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)：沒有細胞能在含有萘啶酮酸和氨芐青霉素的平板上生長，從而否定了固定化通過質粒轉移提高質粒穩(wěn)定性的可能。因此，固定化培養(yǎng)細胞中質粒拷貝數(shù)的增加和凝膠中有限的細胞 分裂次數(shù)是提高質粒穩(wěn)定性的基本因素 第十三章 基因工程菌的發(fā)酵 近年來，重組 DNA 技術 (基因工程 )已開始由實驗室走向工業(yè)生產，走向實用。它不僅為我們提供了一種極為有效的菌種改良技術和手段，也為攻克醫(yī)學上的疑難雜癥 —— 癌、遺傳病及艾滋病的深入研究和最后的治愈提供了可能；為農業(yè)的第三次革命提供了基礎；為深入探索生命的奧秘提供了有力的手段?，F(xiàn)在由工程菌產生的珍稀藥物，如胰島素、干擾素、人生長激素、乙肝表面抗原等等部已先后面市，基因工程不僅保證了這些藥物的來源，而且可使成本大大下降。但是從許多研究中發(fā)現(xiàn)，工程 菌在保存過程中及發(fā)酵生產過程中表現(xiàn)出不穩(wěn)定性，因而工程菌不穩(wěn)定性的解決已日益受到重視并成為基因工程這一高技術成就轉化為生產力的關鍵之一。 第一節(jié) 工程菌的來源和應用 一、何謂基因工程 基因工程 （ geic engineering）是指在基因水平上，采用與工程設計十分類似的方法，根據(jù)人們的意愿，主要是在體外進行基因切割、拼接和重新組合，再轉入生物體內，產生出人們所期望的產物，或創(chuàng)造出具有新的遺傳特征的生物類型，并能使之穩(wěn)定地遺傳給后代。 基因工程的核心技術是 DNA 的重組技術。重組即利用供體生物的遺傳物 質或人工合成的基因，經(jīng)過體外或離體的限制酶切割后與適當?shù)妮d體連接起來形成重組DNA 分子，然后在將重組 DNA 分子導入到受體細胞或受體生物構建轉基因生物，該種生物就可以按人類事先設計好的藍圖表現(xiàn)出另外一種生物的某種性狀。除 DNA重組技術外，基因工程還應包括基因的表達技術，基因的突變技術，基因的導入技術等。 基因工程一般分為 4 個步驟： 一是取得符合人們要求的 DNA 片段，這種 DNA 片段被稱為 “目的基因 ”；二是將目的基因與質?；虿《?DNA 連接成重組 DNA；三是把重組 DNA 引入某種細胞；四是把目的基因能表達的受體細胞 挑選出來。 DNA 分子很小，其直徑只有 20 埃，約相當于五百萬分之一厘米，在它們身上進行 “手術 ”是非常困難的，因此基因工程實際上是一種 “ 超級顯微工程 ” ，對 DNA 的切割、縫合與轉運，必須有特殊的工具。 要把目的基因從供體 DNA 長鏈中準確地剪切下來，可不是一件容易的事。 1968 年，沃納 阿爾伯博士、丹尼爾 內森斯博士和漢密爾 史密斯博士第一次從大腸桿菌中提取出了限制性內切酶，它能夠在 DNA 上尋找特定的 “切點 ”，認準后將 DNA 分子的雙鏈交錯地切斷。人們把這種限制性內切酶稱為 “分子剪刀 ”。這種 “分子剪刀 ”可 以完整地切下個別基因。自 70 年代以來，人們已經(jīng)分離提取了 400 多種 “分子剪刀 ”。有了形形色色的 “分子剪刀 ”，人們就可以隨心所欲地進行 DNA 分子長鏈的切割了。 DNA 的分子鏈被切開后，還得縫接起來以完成基因的拼接。 1976 年，科學們在 5個實驗室里幾乎同時發(fā)現(xiàn)并提取出一種酶，這種酶可以將兩個 DNA 片段連接起來，修復好 DNA 鏈的斷裂口。 1974 年以后，科學界正式肯定了這一發(fā)現(xiàn)，并把這種酶叫作 DNA 連接酶。從此， DNA 連接酶就成了名符其實的 “縫合 ”基因的 “分子針線 ”。只要在用同一種 “分子剪刀 ”剪切的兩種 DNA 碎片中加上 “分子針線 ”，就會把兩種DNA 片段重新連接起來。把 “拼接 ”好的 DNA 分子運送到受體細胞中去，必須尋找一種分子小、能自由進出細胞，而且在裝載了外來的 DNA 片段后仍能照樣復制的運載體。理想的運載體是質粒，因為質粒能自由進出細菌細胞，應當用 “分子剪刀 ”把它切開，再給它安裝上一段外來的 DNA 片段后，它依然如故地能自我復制。有了限制性內切酶、連接酶及運載體，進行基因工程就可以如愿以償了。運載體將目的基因運到受體細胞是基因工程的最后一步，目的基因的導入過程是肉眼看不到的。因此，要知道導入是否成功，事先應 找到特定的標志。例如我們用一種經(jīng)過改造的抗四環(huán)素質粒 PSC100 作載體，將一種基因移入自身無抗性的大腸桿菌時，如果基因移入后大腸桿菌不能被四環(huán)素殺死，就說明轉入獲得成功了。 二、工程菌的獲得 1，確定目的產物。 2，找出產該產物的細胞。 3，將細胞破碎后提純出全部信使 RNA。這些信使中包含了該細胞內表達的所有蛋白質的合成信息。 4，利用基因擴增技術（ PCR），找出所需的目的基因。 5，將目的基因連接到設計好的質粒載體，形成了重組 DNA 分子。 6，將重組后 DNA 分子引入到受體細胞內，然后選擇合適的培養(yǎng)條 件使細胞繁殖。根據(jù)選擇性標記，從菌落中篩選出目的基因的重組 (工程 )菌。 三、工程菌應具備的條件 1，發(fā)酵產品是高濃度、高轉化率和高產率的，同時是分泌型菌株。 2，菌株能利用常用的碳源，并可進行連續(xù)發(fā)酵。 3，菌株不是致病株，也不產內毒素。 4，代謝控制容易進行。 5，能進行適當?shù)?DNA 重組，并且穩(wěn)定，重組的 DNA 不易脫落。 四、工程菌的應用 1，基因藥物 例如，紅細胞生成素、胰島素、干優(yōu)素、乙肝疫苗、生長激素和粒細胞巨噬細胞集落刺激因子等。 2，其它發(fā)酵產品 例如酶制劑、氨基酸（蘇氨酸、色氨酸）、抗生素 等。 第二節(jié) 工程菌的培養(yǎng) 就生產流程而言，從發(fā)酵到分離、純化目標產物，工程菌和常規(guī)微生物并無太多的差異。但工程菌在保存過程中及發(fā)酵生產過程中表現(xiàn)出不穩(wěn)定性，以及安全性等問題，使得工程菌的培養(yǎng)有著自身所特有的特點。 一、安全問題 關于基因工程的社會問題，必須提到它的潛在危險性。經(jīng)過重組的菌和質粒一旦用于，工業(yè)化生產，就不可避免地進入自然界。這些菌能間接地危害人體健康，使治療藥物失去效用，污染環(huán)境等。因此，安全問題是極其重要的。 1974 年，提出了 DNA 重組實驗具有潛在生物危險性的問題。后 來，美、日等國都制定了有關 DNA 重組實驗的準則，即在試管內用酶等構建異種 DNA 的重組分子，并用它轉入活細胞中的實驗，以及使用重組體的實驗應遵循的規(guī)程。其目的是保證實驗的安全和推動重組 DNA 的研究。這些準則參照了防止病原微生物污染的措施，以及根據(jù)對實驗安全度的評定，采用物理密封 (P1~P4)和生物學密封 (B1 和 B2)兩種方法。 物理密封是將重組菌封閉于設備內，以防止傳染給實驗人員和向外界擴散。實驗規(guī)模在 20L以下時，物理密封由密封設施、實驗室設計和實驗注意事項組成。密封程度分為 P P P3 和 P4 級，數(shù)字越大，密封水平越高。生物學密封要求用只有在特殊培養(yǎng)條件下才能生存的宿主，同時用不能轉移至其它活細胞的載體，通過這樣組合的宿主載體系統(tǒng)，可以防止重組菌向外擴散。按密封程度分 B1 和 B2 級，B2 級的密封要求最嚴格。 企業(yè)中進行重組菌培養(yǎng)時的設備標準有 LS1 和 LS2。 LS2 相當嚴格，工業(yè)生產起碼應在 LS1 的設備標 準下培養(yǎng)。 LS1 標準要點是： (1)使用防止重組菌體外漏，能在密閉狀態(tài)下進行內部滅菌的培養(yǎng)裝置； (2)培養(yǎng)裝置的排氣由除菌器排出； (3)使用易產氣溶膠的設備時，要安裝可收