【正文】 樣程序大致相同。 6，排液 培養(yǎng)后要將培養(yǎng)液輸送至貯罐等下一道工序，這時也有可能產(chǎn)生氣溶膠和重組菌的擴散。此外，必須設(shè)置警報系統(tǒng)監(jiān)測培養(yǎng)罐壓力， 以免發(fā)生異常。而且發(fā)酵液中產(chǎn)物濃度也較稀，雜質(zhì)又多，加上一般大分子較小分子不穩(wěn)定 (如對剪切力 )，故提取較困難，常需利用高分辨力的精制方法，如色層分離等。 。 (2)基因工程產(chǎn)品大多處于細胞內(nèi)，提取前需將細胞破碎，增添了很多困難。 可是實際操作者必須小心謹慎，否則難以防止因疏忽而造成的重組菌的擴散。簡單的安全接種法是將種子瓶與培養(yǎng)罐以管相連接后，用無菌空氣加壓壓入的方法。為了減少操作人員接近工程菌的機會，盡量不用人工操作而采用自動取樣裝置最為安全。此法可在培養(yǎng)液不接觸外界的條件下取樣。但若考慮培養(yǎng)液外漏的情況，培養(yǎng)基因重組菌時，以用上部攪拌的雙機械密封為好。這是培養(yǎng)結(jié)束后滅菌時最易外漏的所在。使用膜濾器時，因濾器表面凝結(jié)水汽，壓力損失驟增，深度型濾器除菌效率也會因水汽凝結(jié)而下降。為減少培養(yǎng)液的蒸發(fā)量和降低排氣的相對濕度。電熱器之后附有冷凝器，旨在使高溫的排氣冷卻，以防膜濾器燒毀?？傊?，排氣過程中含有相當(dāng)多的菌?，F(xiàn)分別說明如下。 現(xiàn)今使用的微生物培養(yǎng)裝置，按其滅菌法又可分兩類。過濾達 15min后培養(yǎng)液中已測不出色氨酸，表達效率增加， β半乳糖苷酶活力劇增。 3，表達效率及質(zhì)粒拷貝數(shù)控制 在基因工程細胞培養(yǎng)工程中，表達效率與質(zhì)粒拷貝數(shù)有關(guān)。只有在 Sm存在下宿主才能生長，但重組質(zhì)粒上含有 Sm非依賴性 (Smid)基因，將重組質(zhì)粒導(dǎo)入宿主細胞后，所獲克隆菌可在不含抗生素培養(yǎng)基中生長，而丟失質(zhì)粒菌株卻不能生長。培養(yǎng)過程細胞對維生素需求量甚微，在培養(yǎng)開始即加入必需量對細胞生長并無影響，但培養(yǎng)一開始即加入足夠量氨基酸則可能因氨基酸濃度過大而抑制細胞生長。至于影響基因工程細胞培養(yǎng)的細胞生物量得率與產(chǎn)物量的因素及有關(guān)參數(shù)。實踐表明，基因工程細胞工業(yè)化培養(yǎng)中 ，產(chǎn)物的產(chǎn)率往往比實驗室培養(yǎng)規(guī)模為低。按密封程度分 B1 和 B2 級，B2 級的密封要求最嚴格。 1974 年，提出了 DNA 重組實驗具有潛在生物危險性的問題。 四、工程菌的應(yīng)用 1，基因藥物 例如，紅細胞生成素、胰島素、干優(yōu)素、乙肝疫苗、生長激素和粒細胞巨噬細胞集落刺激因子等。 5，將目的基因連接到設(shè)計好的質(zhì)粒載體，形成了重組 DNA 分子。運載體將目的基因運到受體細胞是基因工程的最后一步，目的基因的導(dǎo)入過程是肉眼看不到的。 DNA 的分子鏈被切開后，還得縫接起來以完成基因的拼接。 1968 年，沃納 但是從許多研究中發(fā)現(xiàn)，工程 菌在保存過程中及發(fā)酵生產(chǎn)過程中表現(xiàn)出不穩(wěn)定性，因而工程菌不穩(wěn)定性的解決已日益受到重視并成為基因工程這一高技術(shù)成就轉(zhuǎn)化為生產(chǎn)力的關(guān)鍵之一。例如將具有 pTG201 和不具 pTG201 的 混合，游離培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn) P＋ 細胞很快消失，而共固定化后的培養(yǎng)則 P＋ 細胞和 P細胞能維持恒定比例達 80 代以上。固定化細胞對廢水中酚類等有毒物質(zhì)的降解能力遠大于游離細胞。在 200 升的反應(yīng)器中， L色氨酸的產(chǎn)率可達到 110g/L。 細胞再循環(huán)系統(tǒng)（ Cell recycle systems ） In a fermenter with cell recycle the cells are separated from the effluent and then recycled back to the fermenter。但目前大多數(shù)制備成顆粒狀珠體。 五、固定化方法的比較 吸附法：條件溫和、方法簡便、載體可再生。塑料 3，影響吸附固定 化的因素 （ 1） Z電位 （ 2）細胞的性質(zhì)和細胞壁的組成 （ 3）載體的性質(zhì) （ 4） pH 二、共價結(jié)合法 利用細胞表面的反應(yīng)基團（如氨基、羧基、羥基、巰基、咪唑基）與活化的無機或有機載體反應(yīng)，形成共價鍵將細胞固定。 （ 2）活細胞：包括增殖細胞、靜止細胞、饑餓細胞。第十四章 固定化細胞發(fā)酵 Fermentation with immobilized cells 第一節(jié) 概述 一、定義 固定化細胞就是被限制自由移動的細胞，既細胞受到物理化學(xué)等因素約束或限制在一定的空間界限內(nèi)，但細胞仍保留催化活性并具備能被反復(fù)或連續(xù)使用的活力。適用于一種酶催化的反應(yīng)。 2，載體的材料 采用吸附法固定細胞，所用的載體主要有：硅藻土、木屑、多孔玻璃、活性炭、 多孔陶瓷、離子交換樹脂和等。 常用的包埋劑為：聚丙烯酰胺、瓊脂、海藻酸、卡拉膠、二醋酸纖維、三醋酸纖維、明膠等。 第三節(jié)固定化細胞的形狀及性質(zhì) 一、形狀 固定化細胞由于其用途和制備方法不同，可以是顆粒狀、塊狀、條狀、薄膜狀或不規(guī)則狀等。 二、固定化細胞反應(yīng)器的類型 固定化細胞反應(yīng)器包括以下幾種類型：細胞再循環(huán)系統(tǒng)（ Cell recycle systems ）、固定床反應(yīng)器（ Fixed bed reactors ）、流化床反應(yīng)器（ Fluidized bed reactors ）、絮凝細胞系統(tǒng)（ Flocculated cell systems ）。 三、氨基酸的生產(chǎn) 例如固定化 Escherichia coli 和 Pseudomonas putida，將 D， L絲氨酸和吲哚轉(zhuǎn)化為 L色氨酸。 2，含酚廢水 含酚廢水的處理普遍采用活性污泥法，但此法存在污泥產(chǎn)率高，易產(chǎn)生污泥流失，處理效率低等缺點。固定化基質(zhì)中的微小區(qū)室使細胞經(jīng)過有限 次的分裂形成小克隆， Nasri 等人發(fā)現(xiàn)無論接種量如何這些小克隆在釋放到培養(yǎng)液中去之前只能繁殖 10～ 16 代，在此過程中即使出現(xiàn) P細胞，也會由于延遲期的存在使其無法與 P＋ 細胞競爭而占據(jù)培養(yǎng)物中的大多數(shù)?，F(xiàn)在由工程菌產(chǎn)生的珍稀藥物，如胰島素、干擾素、人生長激素、乙肝表面抗原等等部已先后面市，基因工程不僅保證了這些藥物的來源，而且可使成本大大下降。 要把目的基因從供體 DNA 長鏈中準確地剪切下來，可不是一件容易的事。有了形形色色的 “分子剪刀 ”，人們就可以隨心所欲地進行 DNA 分子長鏈的切割了。有了限制性內(nèi)切酶、連接酶及運載體，進行基因工程就可以如愿以償了。 4，利用基因擴增技術(shù)（ PCR），找出所需的目的基因。 5，能進行適當(dāng)?shù)?DNA 重組，并且穩(wěn)定，重組的 DNA 不易脫落。因此，安全問題是極其重要的。生物學(xué)密封要求用只有在特殊培養(yǎng)條件下才能生存的宿主，同時用不能轉(zhuǎn)移至其它活細胞的載體，通過這樣組合的宿主載體系統(tǒng)，可以防止重組菌向外擴散。但亦有其自身持點。 三、基因工程細胞的培養(yǎng) 前已述及，基因工程細胞的培 養(yǎng)過程與一般需氧細胞培養(yǎng)基本一致，同時培養(yǎng)方式亦無差異，可采用各種分批培養(yǎng)方式，亦可采用連續(xù)培養(yǎng)、半連續(xù)培養(yǎng)及透析培養(yǎng)等方式。 從生物安全性考慮，培養(yǎng)的基因工程菌通常是維生素或氨基酸的營養(yǎng)缺陷型突變株。其方法是通過誘變使宿主成為某抗生素依賴性突變株 (如鏈霉素依賴性Smd)。但是培養(yǎng)基也與質(zhì)粒穩(wěn)定性有關(guān)，采用天然培養(yǎng)基培產(chǎn)時質(zhì)粒穩(wěn)定件較用合成培養(yǎng)基為高，在天然培養(yǎng)基中即使無選擇壓力亦可保持質(zhì)粒的穩(wěn)定性，因此，用天然培養(yǎng)基進行連續(xù)培養(yǎng)是獲得質(zhì)粒穩(wěn)定性的良好方法。如用含有在色氨酸啟動子下游接有 β半乳糖苷酶基因的重組質(zhì)粒 pMCT98 的基因工程菌進行單級連續(xù)培養(yǎng)，并結(jié)合 孔徑陶瓷過濾器裝置 (圖 722)，開始培養(yǎng)液含色氨酸，表達效率低，當(dāng)生長濁度達到 10 時，進行交叉流動過濾，且供給不含色氨酸料液，結(jié)果如圖 723 所示。按實驗準則，可把這類密閉型通氣攪拌式培養(yǎng)罐劃分為操作液量 20L以上和 20L以下兩種。針對這些均應(yīng)采取一些措施以防菌體外漏。再有，提高通氣速度時，單位體積的排氣中，大腸桿菌和酵母菌菌數(shù)都增加，通氣速度與漏菌數(shù)之間也密切相關(guān)。C 左右。 圖 1110 是基因重組菌培養(yǎng)裝置中普遍采用的排氣除菌系統(tǒng)。無論使用哪種類型的濾器，都應(yīng)對排氣進行去濕處理。同時，滅菌時的熱膨脹差也會使流出量增加。從培養(yǎng)裝置的使用優(yōu)點及攪拌軸長度等角度看，用下攪拌為好。對此，必須采取措施，如用取樣工具進行取樣 (圖1111)。 但是這些操作都由人工控制，操作中難免出錯。 5，接種 向罐內(nèi)直接接種的方法是不安全的。圖中所示的管路能分離并排出污染重組菌的污水。 四、基因工程產(chǎn)品的提取和精制 傳統(tǒng)的發(fā)酵產(chǎn)品和基因工程產(chǎn)品在提取和精制上的不同，主要表現(xiàn)在下列兩方面： (1)傳統(tǒng)發(fā)酵產(chǎn)品多為小分子 (工業(yè)用酶除外，但它們對純度要求不高，提取方法較簡單 )，其理化性能 ，如平衡關(guān)系等數(shù)據(jù)都已知，因此放大比較有根據(jù)；相反，基因工程產(chǎn)品都是大分子，必要數(shù)據(jù)缺乏，放大多憑經(jīng)驗。例如用密封操作的離心機進行菌體分離時，整個機器處在密閉狀態(tài)，在排氣口裝有