【正文】 例如用密封操作的離心機(jī)進(jìn)行菌體分離時(shí)，整個(gè)機(jī)器處在密閉狀態(tài)，在排氣口裝有一無(wú)菌過濾器，同時(shí)有一根空氣回路以幫助平衡在排放固體時(shí)系統(tǒng)的壓力，無(wú)菌過濾器用來排放過量的氣體和空氣，但不會(huì)使微生物排放到系統(tǒng)外。在其它方面，基因工程產(chǎn)品的提取方法與傳統(tǒng)發(fā)酵產(chǎn)品相似，詳見下篇 (下游加工過程 )。 四、基因工程產(chǎn)品的提取和精制 傳統(tǒng)的發(fā)酵產(chǎn)品和基因工程產(chǎn)品在提取和精制上的不同，主要表現(xiàn)在下列兩方面： (1)傳統(tǒng)發(fā)酵產(chǎn)品多為小分子 (工業(yè)用酶除外，但它們對(duì)純度要求不高，提取方法較簡(jiǎn)單 )，其理化性能 ，如平衡關(guān)系等數(shù)據(jù)都已知，因此放大比較有根據(jù)；相反，基因工程產(chǎn)品都是大分子，必要數(shù)據(jù)缺乏，放大多憑經(jīng)驗(yàn)。 另外，培養(yǎng)后的后處理工序中也必須采取防污措施。圖中所示的管路能分離并排出污染重組菌的污水。安全的方法是在培養(yǎng)開始前就將排液口與下段工序相連接并進(jìn)行滅菌，這 樣培養(yǎng)于結(jié)束即可直接輸送培養(yǎng)液。 5，接種 向罐內(nèi)直接接種的方法是不安全的。同時(shí)，取樣過程因采用程序系統(tǒng)控制而易于變動(dòng)。 但是這些操作都由人工控制，操作中難免出錯(cuò)。卸下經(jīng)滅菌的連結(jié)器，在安全柜中卸下樣品管。對(duì)此，必須采取措施，如用取樣工具進(jìn)行取樣 (圖1111)。目前大至 90L培養(yǎng)罐，已能用強(qiáng)磁力進(jìn)行動(dòng)力傳動(dòng)。從培養(yǎng)裝置的使用優(yōu)點(diǎn)及攪拌軸長(zhǎng)度等角度看，用下攪拌為好。 雙機(jī)械密封是用高于罐內(nèi)壓的壓力，將貯存于另一潤(rùn)滑液槽中的無(wú)菌水壓入機(jī)械密封部，用作軸封潤(rùn)滑液。同時(shí)，滅菌時(shí)的熱膨脹差也會(huì)使流出量增加。作為這部分的軸封使用的是機(jī)械密封，有單機(jī)械密封和 雙機(jī)械密封之分。無(wú)論使用哪種類型的濾器，都應(yīng)對(duì)排氣進(jìn)行去濕處理。相對(duì)濕度降低可預(yù)防濾器上凝結(jié)水汽。 圖 1110 是基因重組菌培養(yǎng)裝置中普遍采用的排氣除菌系統(tǒng)。結(jié)果表明， 排氣僅通過藥劑還不能完全滅菌。C 左右。進(jìn)而考察了該排氣鼓泡瓶中加入藥劑 (如 2mol/L NaOH)的效果。再有，提高通氣速度時(shí)，單位體積的排氣中，大腸桿菌和酵母菌菌數(shù)都增加，通氣速度與漏菌數(shù)之間也密切相關(guān)。 以往培養(yǎng)病原菌時(shí)；為防止菌體外流，采取加藥劑槽的方法，但效果如何尚有疑問。針對(duì)這些均應(yīng)采取一些措施以防菌體外漏。 因此，采用高壓滅菌器滅菌的小型培養(yǎng)罐時(shí)應(yīng)在安全柜內(nèi)運(yùn)轉(zhuǎn)。按實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)則，可把這類密閉型通氣攪拌式培養(yǎng)罐劃分為操作液量 20L以上和 20L以下兩種。 第三節(jié)工程菌分批培養(yǎng)動(dòng)力學(xué) 對(duì)于質(zhì)粒脫落性不穩(wěn)定，細(xì)胞在分裂時(shí)丟失質(zhì)粒的概率為 p，則 所以 對(duì)于底物 對(duì)于產(chǎn)物 第四節(jié) 培養(yǎng)裝置與產(chǎn)物的提取 工程菌的培養(yǎng)與普通微生物的培養(yǎng)方法類似。如用含有在色氨酸啟動(dòng)子下游接有 β半乳糖苷酶基因的重組質(zhì)粒 pMCT98 的基因工程菌進(jìn)行單級(jí)連續(xù)培養(yǎng)，并結(jié)合 孔徑陶瓷過濾器裝置 (圖 722)，開始培養(yǎng)液含色氨酸，表達(dá)效率低，當(dāng)生長(zhǎng)濁度達(dá)到 10 時(shí)，進(jìn)行交叉流動(dòng)過濾，且供給不含色氨酸料液，結(jié)果如圖 723 所示。如圖 721 所示，在 25℃下，培養(yǎng)含有穿梭質(zhì)粒 pCP3的E． coli C600/pCI857 至濁度為 5。但是培養(yǎng)基也與質(zhì)粒穩(wěn)定性有關(guān)，采用天然培養(yǎng)基培產(chǎn)時(shí)質(zhì)粒穩(wěn)定件較用合成培養(yǎng)基為高，在天然培養(yǎng)基中即使無(wú)選擇壓力亦可保持質(zhì)粒的穩(wěn)定性，因此，用天然培養(yǎng)基進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)是獲得質(zhì)粒穩(wěn)定性的良好方法。根據(jù)以上方程計(jì)算結(jié)果， Fn變化情況如圖 720 所示。其方法是通過誘變使宿主成為某抗生素依賴性突變株 (如鏈霉素依賴性Smd)。按每克干菌體成本計(jì)，應(yīng)用蘇氨酸成本最高，故應(yīng)避免應(yīng)用蘇氨酸缺陷型菌株為宿主，最好選用維生素缺陷型菌株為宿主。 從生物安全性考慮，培養(yǎng)的基因工程菌通常是維生素或氨基酸的營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株。這里僅對(duì)基因工程菌的營(yíng)養(yǎng)控制、質(zhì)粒穩(wěn)定性、重組質(zhì)?？截悢?shù)的控制及表達(dá)效率作簡(jiǎn)單討論。 三、基因工程細(xì)胞的培養(yǎng) 前已述及，基因工程細(xì)胞的培 養(yǎng)過程與一般需氧細(xì)胞培養(yǎng)基本一致，同時(shí)培養(yǎng)方式亦無(wú)差異，可采用各種分批培養(yǎng)方式，亦可采用連續(xù)培養(yǎng)、半連續(xù)培養(yǎng)及透析培養(yǎng)等方式。其次為提高基因工程 細(xì)胞表達(dá)效率，需采取適當(dāng)措施，提高重組 DNA 在宿主細(xì)胞內(nèi)的拷貝數(shù)及促進(jìn)表達(dá)產(chǎn)物自細(xì)胞內(nèi)向細(xì)胞外分泌。但亦有其自身持點(diǎn)。 LS1 標(biāo)準(zhǔn)要點(diǎn)是： (1)使用防止重組菌體外漏，能在密閉狀態(tài)下進(jìn)行內(nèi)部滅菌的培養(yǎng)裝置； (2)培養(yǎng)裝置的排氣由除菌器排出； (3)使用易產(chǎn)氣溶膠的設(shè)備時(shí)，要安裝可收集氣溶膠的安全箱等。生物學(xué)密封要求用只有在特殊培養(yǎng)條件下才能生存的宿主，同時(shí)用不能轉(zhuǎn)移至其它活細(xì)胞的載體，通過這樣組合的宿主載體系統(tǒng)，可以防止重組菌向外擴(kuò)散。這些準(zhǔn)則參照了防止病原微生物污染的措施，以及根據(jù)對(duì)實(shí)驗(yàn)安全度的評(píng)定，采用物理密封 (P1~P4)和生物學(xué)密封 (B1 和 B2)兩種方法。因此，安全問題是極其重要的。但工程菌在保存過程中及發(fā)酵生產(chǎn)過程中表現(xiàn)出不穩(wěn)定性，以及安全性等問題，使得工程菌的培養(yǎng)有著自身所特有的特點(diǎn)。 5，能進(jìn)行適當(dāng)?shù)?DNA 重組，并且穩(wěn)定，重組的 DNA 不易脫落。 三、工程菌應(yīng)具備的條件 1，發(fā)酵產(chǎn)品是高濃度、高轉(zhuǎn)化率和高產(chǎn)率的，同時(shí)是分泌型菌株。 4，利用基因擴(kuò)增技術(shù)（ PCR），找出所需的目的基因。 二、工程菌的獲得 1，確定目的產(chǎn)物。有了限制性內(nèi)切酶、連接酶及運(yùn)載體，進(jìn)行基因工程就可以如愿以償了。從此， DNA 連接酶就成了名符其實(shí)的 “縫合 ”基因的 “分子針線 ”。有了形形色色的 “分子剪刀 ”，人們就可以隨心所欲地進(jìn)行 DNA 分子長(zhǎng)鏈的切割了。史密斯博士第一次從大腸桿菌中提取出了限制性內(nèi)切酶，它能夠在 DNA 上尋找特定的 “切點(diǎn) ”，認(rèn)準(zhǔn)后將 DNA 分子的雙鏈交錯(cuò)地切斷。 要把目的基因從供體 DNA 長(zhǎng)鏈中準(zhǔn)確地剪切下來，可不是一件容易的事。重組即利用供體生物的遺傳物 質(zhì)或人工合成的基因，經(jīng)過體外或離體的限制酶切割后與適當(dāng)?shù)妮d體連接起來形成重組DNA 分子，然后在將重組 DNA 分子導(dǎo)入到受體細(xì)胞或受體生物構(gòu)建轉(zhuǎn)基因生物，該種生物就可以按人類事先設(shè)計(jì)好的藍(lán)圖表現(xiàn)出另外一種生物的某種性狀?，F(xiàn)在由工程菌產(chǎn)生的珍稀藥物，如胰島素、干擾素、人生長(zhǎng)激素、乙肝表面抗原等等部已先后面市，基因工程不僅保證了這些藥物的來源，而且可使成本大大下降。除了限制細(xì)胞分裂次數(shù)外，質(zhì)?？截悢?shù)的增加也使得質(zhì)粒的穩(wěn)定性提高， Sayadi 等的實(shí)驗(yàn)表明： (pTG201)固定化培養(yǎng)物中質(zhì)粒拷貝數(shù)一直穩(wěn)定在 250 左右。固定化基質(zhì)中的微小區(qū)室使細(xì)胞經(jīng)過有限 次的分裂形成小克隆， Nasri 等人發(fā)現(xiàn)無(wú)論接種量如何這些小克隆在釋放到培養(yǎng)液中去之前只能繁殖 10～ 16 代，在此過程中即使出現(xiàn) P細(xì)胞，也會(huì)由于延遲期的存在使其無(wú)法與 P＋ 細(xì)胞競(jìng)爭(zhēng)而占據(jù)培養(yǎng)物中的大多數(shù)。與游離細(xì)胞相比，固定化細(xì)胞表現(xiàn)生長(zhǎng)穩(wěn)定，降解能力強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)。 2，含酚廢水 含酚廢水的處理普遍采用活性污泥法，但此法存在污泥產(chǎn)率高，易產(chǎn)生污泥流失，處理效率低等缺點(diǎn)。 四、酶制劑的生產(chǎn) 五、生物轉(zhuǎn)化 六、廢水處理 1，處理氨、氮廢水 微生物去除氨氮 需經(jīng)過硝化、厭氧反硝化兩個(gè)階段。 三、氨基酸的生產(chǎn) 例如固定化 Escherichia coli 和 Pseudomonas putida，將 D， L絲氨酸和吲哚轉(zhuǎn)化為 L色氨酸。從理論上，阻止固定化細(xì)胞的增殖是可能的，因而可以使用較稀的培養(yǎng)基來連續(xù)合成抗生素。 二、固定化細(xì)胞反應(yīng)器的類型 固定化細(xì)胞反應(yīng)器包括以下幾種類型：細(xì)胞再循環(huán)系統(tǒng)（ Cell recycle systems ）、固定床反應(yīng)器（ Fixed bed reactors ）、流化床反應(yīng)器（ Fluidized bed reactors ）、絮凝細(xì)胞系統(tǒng)（ Flocculated cell systems ）。但用同一方法包埋的大腸桿菌中的青霉素酰胺酶的最適 pH 則沒有變動(dòng)。 第三節(jié)固定化細(xì)胞的形狀及性質(zhì) 一、形狀 固定化細(xì)胞由于其用途和制備方法不同，可以是顆粒狀、塊狀、條狀、薄膜狀或不規(guī)則狀等。但由于試劑的毒性，易引起細(xì)胞的破壞。 常用的包埋劑為：聚丙烯酰胺、瓊脂、海藻酸、卡拉膠、二醋酸纖維、三醋酸纖維、明膠等。常用的交聯(lián)劑包括：戊二醛、甲苯二異氰酸酯、雙重氮聯(lián)苯胺。 2，載體的材料 采用吸附法固定細(xì)胞，所用的載體主要有：硅藻土、木屑、多孔玻璃、活性炭、 多孔陶瓷、離子交換樹脂和等。下面對(duì)這幾種做具體介紹。適用于一種酶催化的反應(yīng)。 （ 8）發(fā)酵液中菌體含量少，有利與產(chǎn)品的分離純化。第十四章 固定化細(xì)胞發(fā)酵 Fermentation with immobilized cells 第一節(jié) 概述 一、定義 固定化細(xì)胞就是被限制自由移動(dòng)的細(xì)胞，既細(xì)胞受到物理化學(xué)等因素約束或限制在一定的空間界限內(nèi)，但細(xì)胞仍保留催化活性并具備能被反復(fù)