【正文】 一無菌過濾器，同時有一根空氣回路以幫助平衡在排放固體時系統(tǒng)的壓力，無菌過濾器用來排放過量的氣體和空氣，但不會使微生物排放到系統(tǒng)外。在其它方面，基因工程產(chǎn)品的提取方法與傳統(tǒng)發(fā)酵產(chǎn)品相似，詳見下篇 (下游加工過程 )。 另外，培養(yǎng)后的后處理工序中也必須采取防污措施。安全的方法是在培養(yǎng)開始前就將排液口與下段工序相連接并進行滅菌，這 樣培養(yǎng)于結(jié)束即可直接輸送培養(yǎng)液。同時，取樣過程因采用程序系統(tǒng)控制而易于變動。卸下經(jīng)滅菌的連結(jié)器，在安全柜中卸下樣品管。目前大至 90L培養(yǎng)罐，已能用強磁力進行動力傳動。 雙機械密封是用高于罐內(nèi)壓的壓力，將貯存于另一潤滑液槽中的無菌水壓入機械密封部，用作軸封潤滑液。作為這部分的軸封使用的是機械密封，有單機械密封和 雙機械密封之分。相對濕度降低可預(yù)防濾器上凝結(jié)水汽。結(jié)果表明， 排氣僅通過藥劑還不能完全滅菌。進而考察了該排氣鼓泡瓶中加入藥劑 (如 2mol/L NaOH)的效果。 以往培養(yǎng)病原菌時；為防止菌體外流，采取加藥劑槽的方法，但效果如何尚有疑問。 因此，采用高壓滅菌器滅菌的小型培養(yǎng)罐時應(yīng)在安全柜內(nèi)運轉(zhuǎn)。 第三節(jié)工程菌分批培養(yǎng)動力學(xué) 對于質(zhì)粒脫落性不穩(wěn)定，細胞在分裂時丟失質(zhì)粒的概率為 p，則 所以 對于底物 對于產(chǎn)物 第四節(jié) 培養(yǎng)裝置與產(chǎn)物的提取 工程菌的培養(yǎng)與普通微生物的培養(yǎng)方法類似。如圖 721 所示，在 25℃下，培養(yǎng)含有穿梭質(zhì)粒 pCP3的E． coli C600/pCI857 至濁度為 5。根據(jù)以上方程計算結(jié)果， Fn變化情況如圖 720 所示。按每克干菌體成本計，應(yīng)用蘇氨酸成本最高，故應(yīng)避免應(yīng)用蘇氨酸缺陷型菌株為宿主，最好選用維生素缺陷型菌株為宿主。這里僅對基因工程菌的營養(yǎng)控制、質(zhì)粒穩(wěn)定性、重組質(zhì)?？截悢?shù)的控制及表達效率作簡單討論。其次為提高基因工程 細胞表達效率，需采取適當(dāng)措施，提高重組 DNA 在宿主細胞內(nèi)的拷貝數(shù)及促進表達產(chǎn)物自細胞內(nèi)向細胞外分泌。 LS1 標(biāo)準(zhǔn)要點是： (1)使用防止重組菌體外漏，能在密閉狀態(tài)下進行內(nèi)部滅菌的培養(yǎng)裝置； (2)培養(yǎng)裝置的排氣由除菌器排出； (3)使用易產(chǎn)氣溶膠的設(shè)備時，要安裝可收集氣溶膠的安全箱等。這些準(zhǔn)則參照了防止病原微生物污染的措施，以及根據(jù)對實驗安全度的評定，采用物理密封 (P1~P4)和生物學(xué)密封 (B1 和 B2)兩種方法。但工程菌在保存過程中及發(fā)酵生產(chǎn)過程中表現(xiàn)出不穩(wěn)定性，以及安全性等問題，使得工程菌的培養(yǎng)有著自身所特有的特點。 三、工程菌應(yīng)具備的條件 1，發(fā)酵產(chǎn)品是高濃度、高轉(zhuǎn)化率和高產(chǎn)率的，同時是分泌型菌株。 二、工程菌的獲得 1，確定目的產(chǎn)物。從此， DNA 連接酶就成了名符其實的 “縫合 ”基因的 “分子針線 ”。史密斯博士第一次從大腸桿菌中提取出了限制性內(nèi)切酶，它能夠在 DNA 上尋找特定的 “切點 ”，認準(zhǔn)后將 DNA 分子的雙鏈交錯地切斷。重組即利用供體生物的遺傳物 質(zhì)或人工合成的基因，經(jīng)過體外或離體的限制酶切割后與適當(dāng)?shù)妮d體連接起來形成重組DNA 分子，然后在將重組 DNA 分子導(dǎo)入到受體細胞或受體生物構(gòu)建轉(zhuǎn)基因生物，該種生物就可以按人類事先設(shè)計好的藍圖表現(xiàn)出另外一種生物的某種性狀。除了限制細胞分裂次數(shù)外，質(zhì)?？截悢?shù)的增加也使得質(zhì)粒的穩(wěn)定性提高， Sayadi 等的實驗表明： (pTG201)固定化培養(yǎng)物中質(zhì)?？截悢?shù)一直穩(wěn)定在 250 左右。與游離細胞相比，固定化細胞表現(xiàn)生長穩(wěn)定，降解能力強的優(yōu)點。 四、酶制劑的生產(chǎn) 五、生物轉(zhuǎn)化 六、廢水處理 1，處理氨、氮廢水 微生物去除氨氮 需經(jīng)過硝化、厭氧反硝化兩個階段。從理論上，阻止固定化細胞的增殖是可能的，因而可以使用較稀的培養(yǎng)基來連續(xù)合成抗生素。但用同一方法包埋的大腸桿菌中的青霉素酰胺酶的最適 pH 則沒有變動。但由于試劑的毒性，易引起細胞的破壞。常用的交聯(lián)劑包括：戊二醛、甲苯二異氰酸酯、雙重氮聯(lián)苯胺。下面對這幾種做具體介紹。 （ 8）發(fā)酵液中菌體含量少，有利與產(chǎn)品的分離純化。 2，與固定化酶相比 與固定化酶相比， 固定化細胞具有以下優(yōu)點： （ 1）免去了破碎細胞提取酶的手續(xù) （ 2）酶在細胞內(nèi)的穩(wěn)定性較高，完整細胞固定化后酶活性損失少 （ 3）固定化細胞制備的成本比固定化酶低 （ 4）無需輔酶再生 三、固定化細胞的缺點 雖然 固定化細胞具有上述許多優(yōu)點，但也有不足之處，具體表現(xiàn)在： 1，僅能利用胞內(nèi) 酶； 2，細胞膜、細胞壁和載體都存在著擴散限制作用； 3，載體形成的孔隙大小影響高分子底物的通透性； 4，可能有副反應(yīng)。 一、吸附法 1，原理 利用載體和細胞表面所帶電荷的靜電引力（ van der Walls forces），使細胞吸附于載體上。 由于交聯(lián)試劑的毒性，這一方法具有一定的局限性。 交聯(lián)法：可得到高細胞濃度，但機械強度低，無法再生，不適于實際應(yīng)用。 2，溫度 類似與 pH，細胞固 定化方法不同，也有可能導(dǎo)致最適溫度產(chǎn)生不同的變化。 二、有機酸的生產(chǎn) 檸檬酸是有機酸中的主要品種，檸檬酸一般是以黑曲 霉為菌種來生產(chǎn)。硝化菌、脫氮菌的增殖速度慢，要想提高去除率，必須要較長的停留時間和較高的細胞濃度。 4，處理重金屬廢水 由于微生物經(jīng)固定化后，其穩(wěn)定性增加，抗生物毒性物質(zhì)的能力也大大增強，因此可以被廣泛地用于各種有機廢水中重金屬離子的去除。電鏡照片顯示固定化細胞間存在緊密接觸，似乎有可能由于質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移而提高了工程菌的穩(wěn)定性，通過將 和 細胞共固定化并培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)：沒有細胞能在含有萘啶酮酸和氨芐青霉素的平板上生長，從而否定了固定化通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)移提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的可能。除 DNA重組技術(shù)外，基因工程還應(yīng)包括基因的表達技術(shù)，基因的突變技術(shù)，基因的導(dǎo)入技術(shù)等。人們把這種限制性內(nèi)切酶稱為 “分子剪刀 ”。只要在用同一種 “分子剪刀 ”剪切的兩種 DNA 碎片中加上 “分子針線 ”，就會把兩種DNA 片段重新連接起來。 2，找出產(chǎn)該產(chǎn)物的細胞。 2，菌株能利用常用的碳源，并可進行連續(xù)發(fā)酵。 一、安全問題 關(guān)于基因工程的社會問題，必須提到它的潛在危險性。 物理密封是將重組菌封閉于設(shè)備內(nèi)，以防止傳染給實驗人員和向外界擴散。設(shè)計用于基因重組菌的培養(yǎng)裝置時，不僅要考慮外部雜菌的侵入，還要防止重組菌的外漏。此外，基因工程細胞的原宿主通常是某些培養(yǎng)物質(zhì) (如某種氨基酸或維生素等 )的缺陷型，有些基因工程細胞生產(chǎn)過程亦產(chǎn)生某些抑制細胞生長的代謝物。 1，底物濃度的控制 在基因工程茵培養(yǎng)過程，至少要遵循 PI級物理防護的規(guī)定，因此必需進行菌體的高密度培養(yǎng)。 質(zhì)粒穩(wěn)定性 重組質(zhì)粒上通常載有 Apr 基因，獲得該類重組質(zhì)粒的基因工程菌在含氨芐青霉素培養(yǎng)液中可以生長，而非基因工程菌不能生長。 由圖 720 可知．假定 P＝ 1%，當(dāng) α＝ 0 時，表明質(zhì)粒丟失菌株不能生長，培養(yǎng)處于最理想的穩(wěn)定狀態(tài)，亦為質(zhì)粒最穩(wěn)定狀態(tài)，此時 Fn 接近于 ；但在無選擇壓力下， α值越大， Fn越低，即質(zhì)粒穩(wěn)定性越差。再將培養(yǎng)溫度提高至 37℃，則質(zhì)粒拷貝數(shù)增加，基因產(chǎn)物 β內(nèi)酰胺酶活性增加 37 倍左右，但 Fn急劇下降。在進行以工業(yè)化為目的的 DNA重組實驗，以及為生產(chǎn)異種基因產(chǎn)物而培養(yǎng)重組菌 時，當(dāng)然應(yīng)采用簡便易行的培養(yǎng)系統(tǒng)。但培養(yǎng)罐稍大，該法就難以使用了。有人試驗證明，排氣中的微生物數(shù)量隨著培養(yǎng)液中菌體濃度和通風(fēng)速度等而變化。 另外，為了解加熱能否對排氣滅菌，進行了與上述類似的實驗。使用藥劑時若能在排氣鼓泡瓶內(nèi)進行攪拌、消泡的話，是會有效果的。除菌濾器與培養(yǎng)罐空氣入口處的相同。前者由單密封面將罐與外界隔開。這時，上、下兩部分即使有一部分的密封液滲漏，培養(yǎng)液也幾乎無外 漏危險。現(xiàn)時，基因重組菌的培養(yǎng)罐仍采用雙機械密封的上攪拌方式為多，其次用雙機械密封 的下攪拌方式。取樣中使用的排水管管道與廢液滅菌貯罐相連，取樣及滅菌時產(chǎn)生的排水一并貯存于罐內(nèi)，經(jīng)滅菌后排出。取出的樣品保存于冷庫內(nèi)，冷庫內(nèi)的空氣經(jīng)濾器過濾，內(nèi)部也可進行滅菌。如果排液口未與下段工序相連那就應(yīng)與連結(jié)廢液滅菌罐的排水管道相接，這樣就安全了。例如，菌體的分離通常使用沙氏 (Sharpres)型離心機；由于很可能產(chǎn)生氣溶膠，故用膜分離法進行濃縮。 目前認為，基因工程產(chǎn)品的回收率達到 40％就已相當(dāng)不錯。 另外，對于基因工程產(chǎn)品，還應(yīng)注意生物安全 (biosafety)問題，即要防止菌體擴散，特別對前面幾步操作，一般要求在密封的環(huán)境下操作。估計能達到大量培養(yǎng)重組菌實驗準(zhǔn)則中 LS— LS2 等物理性密封試驗的標(biāo)準(zhǔn)。重組菌培養(yǎng)罐中，凡有可能外漏重組菌的部分都與排污管道相連。取樣、排液的管道中能產(chǎn)生這類排水，因此，一定要另行安裝排水管并與廢液滅菌貯槽等相連接，以便徘放污水。例如，通過雙層橡