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正文內(nèi)容

固定化細(xì)胞發(fā)酵(已改無錯(cuò)字)

2022-10-02 09:43:01 本頁面
  

【正文】 集氣溶膠的安全箱等。設(shè)計(jì)用于基因重組菌的培養(yǎng)裝置時(shí),不僅要考慮外部雜菌的侵入,還要防止重組菌的外漏。此外,培養(yǎng)后的菌體分離、破碎等處理也必須在安全柜內(nèi)進(jìn)行,或是采用密閉型的設(shè)備。 二、基因工程細(xì)胞培養(yǎng)特點(diǎn) 前已述及,基因工程細(xì)胞培養(yǎng)過程與培養(yǎng)方式與天然細(xì)胞培養(yǎng)過程或方式基本— 致。但亦有其自身持點(diǎn)。實(shí)踐表明,基因工程細(xì)胞工業(yè)化培養(yǎng)中 ,產(chǎn)物的產(chǎn)率往往比實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)規(guī)模為低。其原因主要與基因工程細(xì)胞特點(diǎn)有關(guān),首先基因工程細(xì)胞的生長速率及表達(dá)率與其所載外源 DNA 的穩(wěn)定性及產(chǎn)物分泌過程有關(guān),其中重組 DNA 的穩(wěn)定性尤為重要,重組 DNA 在宿主內(nèi)表達(dá)方式有兩種,其一是游離表達(dá)方式、其二是結(jié)合表達(dá)方式。因此,基因工程細(xì)胞培養(yǎng)過程,重組 DNA 的丟失方式亦有兩種,其一是細(xì)胞培養(yǎng)過程,由于回復(fù)突變或分配作用致使 DNA 丟失.稱為脫落性不穩(wěn)定,其二是重組 DNA 中編碼的結(jié)構(gòu)基因在宿主內(nèi)發(fā)生再重組過程產(chǎn)生突變,不再表達(dá)目的產(chǎn)物,此稱加結(jié)構(gòu)性不穩(wěn)定。其次為提高基因工程 細(xì)胞表達(dá)效率,需采取適當(dāng)措施,提高重組 DNA 在宿主細(xì)胞內(nèi)的拷貝數(shù)及促進(jìn)表達(dá)產(chǎn)物自細(xì)胞內(nèi)向細(xì)胞外分泌。此外,基因工程細(xì)胞的原宿主通常是某些培養(yǎng)物質(zhì) (如某種氨基酸或維生素等 )的缺陷型,有些基因工程細(xì)胞生產(chǎn)過程亦產(chǎn)生某些抑制細(xì)胞生長的代謝物。由此,在培養(yǎng)工程中應(yīng)考慮控制培養(yǎng)液營養(yǎng)成分及其濃度,同時(shí)采取措施,消除抑制細(xì)胞生長的代謝物,以保證細(xì)胞正常生長。由此可見,在基因工程細(xì)胞培養(yǎng)過程,除 — 般培養(yǎng)條件外,必需考慮基因工程細(xì)胞的自身特點(diǎn),確定最佳培養(yǎng)條件。 三、基因工程細(xì)胞的培養(yǎng) 前已述及,基因工程細(xì)胞的培 養(yǎng)過程與一般需氧細(xì)胞培養(yǎng)基本一致,同時(shí)培養(yǎng)方式亦無差異,可采用各種分批培養(yǎng)方式,亦可采用連續(xù)培養(yǎng)、半連續(xù)培養(yǎng)及透析培養(yǎng)等方式。至于影響基因工程細(xì)胞培養(yǎng)的細(xì)胞生物量得率與產(chǎn)物量的因素及有關(guān)參數(shù)。亦可參照普通細(xì)胞相應(yīng)培養(yǎng)方式求得。 目前關(guān)于動(dòng)植物基因工程細(xì)胞培養(yǎng)工程的研究剛剛起步,有待進(jìn) — 步發(fā)展。這里僅對基因工程菌的營養(yǎng)控制、質(zhì)粒穩(wěn)定性、重組質(zhì)??截悢?shù)的控制及表達(dá)效率作簡單討論。 1,底物濃度的控制 在基因工程茵培養(yǎng)過程,至少要遵循 PI級物理防護(hù)的規(guī)定,因此必需進(jìn)行菌體的高密度培養(yǎng)。普通 E. coli 培養(yǎng) 時(shí)最高干重菌體收率可達(dá) 12. 5%,釀酒酵母可得%,浙枯草桿菌僅可得 2%左右。根據(jù)這些結(jié)果采用枯草桿菌不太合適,除非其具有產(chǎn)物的高效分泌系統(tǒng)。 從生物安全性考慮,培養(yǎng)的基因工程菌通常是維生素或氨基酸的營養(yǎng)缺陷型突變株。培養(yǎng)過程細(xì)胞對維生素需求量甚微,在培養(yǎng)開始即加入必需量對細(xì)胞生長并無影響,但培養(yǎng)一開始即加入足夠量氨基酸則可能因氨基酸濃度過大而抑制細(xì)胞生長。在此情況下,可采取培養(yǎng)過程中,在調(diào)節(jié) pH 值同時(shí)補(bǔ)加氨基酸混合物和葡萄糖的方法,以便培養(yǎng)過程葡萄糖及氨基酸濃度的基本恒定,從而實(shí)現(xiàn)高密度培養(yǎng) ,如 E. coli C600 株培養(yǎng)時(shí)可獲得 6%干菌體。但菌體對葡萄糖及氨基酸的收率因培養(yǎng)條件而異,如以葡萄糖及分別用蘇氨酸、亮氨酸、組氨酸及色氨酸為底物時(shí),則平均每克底物所獲干菌體量分別為 、 、 1 40 及 40g 。按每克干菌體成本計(jì),應(yīng)用蘇氨酸成本最高,故應(yīng)避免應(yīng)用蘇氨酸缺陷型菌株為宿主,最好選用維生素缺陷型菌株為宿主。 質(zhì)粒穩(wěn)定性 重組質(zhì)粒上通常載有 Apr 基因,獲得該類重組質(zhì)粒的基因工程菌在含氨芐青霉素培養(yǎng)液中可以生長,而非基因工程菌不能生長。但在基因工程菌高密度培養(yǎng)時(shí),外加的抗生素 AP 易于 失活,影響培養(yǎng)。為此考慮采用抗生素依賴性變異法替代抗生素添加法。其方法是通過誘變使宿主成為某抗生素依賴性突變株 (如鏈霉素依賴性Smd)。只有在 Sm存在下宿主才能生長,但重組質(zhì)粒上含有 Sm非依賴性 (Smid)基因,將重組質(zhì)粒導(dǎo)入宿主細(xì)胞后,所獲克隆菌可在不含抗生素培養(yǎng)基中生長,而丟失質(zhì)粒菌株卻不能生長。此法很有實(shí)用價(jià)值,但缺點(diǎn)是宿主細(xì)胞易產(chǎn)生回復(fù)突變,造成培養(yǎng)工程復(fù)雜化,產(chǎn)物產(chǎn)率下降。 為考察質(zhì)粒穩(wěn)定性,在此引入質(zhì)粒保持率 Fn的概念, Fn表示分批培養(yǎng)中細(xì)胞分裂 n次后,培養(yǎng)液中基因工程細(xì)胞數(shù)與總細(xì)胞數(shù)的 比值,即 假定在分批培養(yǎng)過程中,細(xì)胞在對數(shù)生長期每次分裂時(shí),其質(zhì)粒丟失率為 P,則 Fn為: 式中 α 質(zhì)粒丟失菌株與質(zhì)粒保持率菌株 μ 的比值; n細(xì)胞分裂次數(shù) 理論上基因工程菌載荷外源性基因,培養(yǎng)過程細(xì)胞大量合成外源性產(chǎn)物,其負(fù)荷大于質(zhì)粒丟失菌株,故基因工程菌株比生長速率 μ 通常較質(zhì)拉丟失菌株小,當(dāng)然亦有變化不大者。根據(jù)以上方程計(jì)算結(jié)果, Fn變化情況如圖 720 所示。 由圖 720 可知.假定 P= 1%,當(dāng) α= 0 時(shí),表明質(zhì)粒丟失菌株不能生長,培養(yǎng)處于最理想的穩(wěn)定狀態(tài),亦為質(zhì)粒最穩(wěn)定狀態(tài),此時(shí) Fn 接近于 ;但在無選擇壓力下, α值越大, Fn越低,即質(zhì)粒穩(wěn)定性越差。 在基因工程細(xì)胞的連續(xù)培養(yǎng)方式中,若無選擇壓力,迪常不能得到恒定的穩(wěn)定狀態(tài)。而在有選擇壓力下,則可獲得穩(wěn)定狀態(tài)。但是培養(yǎng)基也與質(zhì)粒穩(wěn)定性有關(guān),采用天然培養(yǎng)基培產(chǎn)時(shí)質(zhì)粒穩(wěn)定件較用合成培養(yǎng)基為高,在天然培養(yǎng)基中即使無選擇壓力亦可保持質(zhì)粒的穩(wěn)定性,因此,用天然培養(yǎng)基進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)是獲得質(zhì)粒穩(wěn)定性的良好方法。 3,表達(dá)效率及質(zhì)??截悢?shù)控制 在基因工程細(xì)胞培養(yǎng)工程中,表達(dá)效率與質(zhì)粒拷貝數(shù)有關(guān)。在質(zhì)粒穩(wěn)定基礎(chǔ)上,應(yīng)盡可能提高細(xì)胞內(nèi)質(zhì)??截悢?shù) 。在工業(yè)生產(chǎn)中易于操作的方法是在培養(yǎng)的不同階段,采用不同培養(yǎng)溫度達(dá)到提高拷貝數(shù)目的,在前培養(yǎng)階段采用低溫,以減少細(xì)胞負(fù)荷,此時(shí)拷貝數(shù)較低,而比生長速率升高,在主培養(yǎng)中途升高溫度,質(zhì)粒拷貝數(shù)增加,目的基因產(chǎn)量提高。如圖 721 所示,在 25℃下,培養(yǎng)含有穿梭質(zhì)粒 pCP3的E. coli C600/pCI857 至濁度為 5。再將培養(yǎng)溫度提高至 37℃,則質(zhì)??截悢?shù)增加,基因產(chǎn)物 β內(nèi)酰胺酶活性增加 37 倍左右,但 Fn急劇下降。此外,利用 λ 噬菌體 PL啟動(dòng)子的溫度敏感性,采用二級連續(xù)培養(yǎng)方式,第 1 罐于低溫下培養(yǎng)以降低表達(dá)效率 ,第 2 罐高溫培養(yǎng),對提高表達(dá)效率亦是有效的。 此外,當(dāng)質(zhì)??截悢?shù)與某些化合物有關(guān)時(shí),亦可采取添加或去除相應(yīng)化合物的雙階段連續(xù)過濾培養(yǎng)法以提高拷貝數(shù)和表達(dá)效率。如用含有在色氨酸啟動(dòng)子下游接有 β半乳糖苷酶基因的重組質(zhì)粒 pMCT98 的基因工程菌進(jìn)行單級連續(xù)培養(yǎng),并結(jié)合 孔徑陶瓷過濾器裝置 (圖 722),開始培養(yǎng)液含色氨酸,表達(dá)效率低,當(dāng)生長濁度達(dá)到 10 時(shí),進(jìn)行交叉流動(dòng)過濾,且供給不含色氨酸料液,結(jié)果如圖 723 所示。過濾達(dá) 15min后培養(yǎng)液中已測不出色氨酸,表達(dá)效率增加, β半乳糖苷酶活力劇增。最終濁度達(dá) 150(相當(dāng)于含 6%干細(xì)胞 ), β半乳糖苷酶約占總蛋白量 8%。 由此可知,在基因工程細(xì)胞培養(yǎng)工程中,需根據(jù)其固有特點(diǎn)和具體情況,采取相應(yīng)措施、提高質(zhì)粒穩(wěn)定性,增加質(zhì)??截悢?shù),實(shí)現(xiàn)培養(yǎng)條件優(yōu)化,提高表達(dá)效率。 第三節(jié)工程菌分批培養(yǎng)動(dòng)力學(xué) 對于質(zhì)粒脫落性不穩(wěn)定,細(xì)胞在分裂時(shí)丟失質(zhì)粒的概率為 p,則 所以 對于底物 對于產(chǎn)物 第四節(jié) 培養(yǎng)裝置與產(chǎn)物的提取 工程菌的培養(yǎng)與普通微生物的培養(yǎng)方法類似。在進(jìn)行以工業(yè)化為目的的 DNA重組實(shí)驗(yàn),以及為生產(chǎn)異種基因產(chǎn)物而培養(yǎng)重組菌 時(shí),當(dāng)然應(yīng)采用簡便易行的培養(yǎng)系統(tǒng)?,F(xiàn)在多半使用大腸桿菌為宿主,而在一般的通氣攪拌罐中大腸桿菌能生長良好。 一、培養(yǎng)裝置 作為基因重組體的培養(yǎng)裝置,與一直沿用的通氣攪拌培養(yǎng)罐要有區(qū)別,即不僅要防止外部微生物侵入罐內(nèi),還必須采用不使培養(yǎng)物外漏的培養(yǎng)裝置。按實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)則,可把這類密閉型通氣攪拌式培養(yǎng)罐劃分為操作液量 20L以上和 20L以下兩種。 現(xiàn)今使用的微生物培養(yǎng)裝置,按其滅菌法又可分兩類。一是在高壓滅菌器中進(jìn)行培養(yǎng)基及培養(yǎng)罐的滅菌,罐本身通常是玻璃制的,容量在 10L以下的居多;另一類是 20L以上的 培養(yǎng)罐,一般為不銹鋼制品,多采用通新鮮蒸氣進(jìn)行滅菌。前者是可移動(dòng)的臺式,罐本身不能承受高壓;后者,蒸汽、空氣等供給是用固定管道連接的,一般不能移動(dòng);這兩類罐要充分考慮不使微生物由罐外進(jìn)入罐內(nèi)的問題,但并不一定要解決防止罐內(nèi)微生物的外漏問題。 因此,采用高壓滅菌器滅菌的小型培養(yǎng)罐時(shí)應(yīng)在安全柜內(nèi)運(yùn)轉(zhuǎn)。但培養(yǎng)罐稍大,該法就難以使用了。 ???????????????pXSKSXSKSdtdXXpSKSdtdXSmSmSm??? )1(????????? ?? 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