【正文】 因此，盡量減少提取步驟是相當重要的。 采取上述措施基本上就能避免培養(yǎng)罐中的基因重組菌外漏了。 三、培養(yǎng)罐的管道布局 圖 1113 表示重組菌培養(yǎng)罐 (P P3 級 )的整體流程圖。 4，培養(yǎng)后的滅菌 培養(yǎng)后對培養(yǎng)液和管道等進行滅菌時，一開始流出的末滅菌排水有可能存在活的重 組菌。此外還設計了 各種安全取樣用的器具。 3，取樣 普通培養(yǎng)罐的取樣管道在取樣時會流出樣品。但上、下兩方同時溢漏時，培養(yǎng)液亦有可能外漏了。此密封部分因高速旋轉產生摩擦熱，故需冷卻和潤滑。 排氣中的微生物（個） 菌種 鼓泡瓶 堿 電熱器 大腸桿菌 釀酒酵母 980 71 611 40 0 0 除菌濾器有經多孔填料除菌的膜型濾器和深度型濾器。用電熱器將排氣加熱至200176。圖 119 的結果表明。用 5L 培養(yǎng)罐 (裝液量 )，以攪拌速度 400r/min，通氣速度 1： 1(VVM)，即 (換算成罐內 通氣速度為 11cm/min)來培養(yǎng)大腸桿菌，發(fā)現每毫升培養(yǎng)液中含 109個菌體，每小時有 150~400 個菌隨氣排出；而培養(yǎng)釀酒酵母時，每小時從每毫升含 108個菌體培養(yǎng)液的排氣中檢出 30~70 個。 ???????????????pXSKSXSKSdtdXXpSKSdtdXSmSmSm??? )1(????????? ?? Xp pXXdXdX mmm ??? )1(dtdXYdtdXYdtdS ???? ??? 11?? ?? XdtdXdtdP ??二、基因重組菌外漏的防范 首先應了解培養(yǎng)微生物在普通通氣攪拌罐中可能發(fā)生外漏的部位和操作?，F在多半使用大腸桿菌為宿主，而在一般的通氣攪拌罐中大腸桿菌能生長良好。此外，利用 λ 噬菌體 PL啟動子的溫度敏感性，采用二級連續(xù)培養(yǎng)方式，第 1 罐于低溫下培養(yǎng)以降低表達效率 ，第 2 罐高溫培養(yǎng)，對提高表達效率亦是有效的。 在基因工程細胞的連續(xù)培養(yǎng)方式中，若無選擇壓力，迪常不能得到恒定的穩(wěn)定狀態(tài)。但在基因工程菌高密度培養(yǎng)時，外加的抗生素 AP 易于 失活，影響培養(yǎng)。普通 E． coli 培養(yǎng) 時最高干重菌體收率可達 12． 5％，釀酒酵母可得%，浙枯草桿菌僅可得 2%左右。由此，在培養(yǎng)工程中應考慮控制培養(yǎng)液營養(yǎng)成分及其濃度，同時采取措施，消除抑制細胞生長的代謝物，以保證細胞正常生長。此外，培養(yǎng)后的菌體分離、破碎等處理也必須在安全柜內進行，或是采用密閉型的設備。實驗規(guī)模在 20L以下時，物理密封由密封設施、實驗室設計和實驗注意事項組成。經過重組的菌和質粒一旦用于，工業(yè)化生產，就不可避免地進入自然界。 3，菌株不是致病株，也不產內毒素。 3，將細胞破碎后提純出全部信使 RNA。把 “拼接 ”好的 DNA 分子運送到受體細胞中去，必須尋找一種分子小、能自由進出細胞，而且在裝載了外來的 DNA 片段后仍能照樣復制的運載體。這種 “分子剪刀 ”可 以完整地切下個別基因。 基因工程一般分為 4 個步驟： 一是取得符合人們要求的 DNA 片段，這種 DNA 片段被稱為 “目的基因 ”；二是將目的基因與質粒或病毒 DNA 連接成重組 DNA；三是把重組 DNA 引入某種細胞；四是把目的基因能表達的受體細胞 挑選出來。因此，固定化培養(yǎng)細胞中質?？截悢档脑黾雍湍z中有限的細胞 分裂次數是提高質粒穩(wěn)定性的基本因素 第十三章 基因工程菌的發(fā)酵 近年來，重組 DNA 技術 (基因工程 )已開始由實驗室走向工業(yè)生產，走向實用。 七、基因工程菌的固定化 游離細胞培養(yǎng)過程中出現的質粒高度不穩(wěn)定性可能是由于如下原因：質粒的高拷貝數對細胞是有害的，并因此使具質粒細胞在與不具質粒細胞的競爭中處于劣勢。采用固定化細胞技術可以做到這點。在發(fā)酵過程中，由于菌體的生長，導致發(fā)酵液粘度的上升，會影響氧的傳遞。 3，穩(wěn)定性 一般而言，細胞經固定化后，其穩(wěn)定性會有所提高。 包埋法：細 胞和載體間沒有束縛，固定化后，細胞仍保持較高活力。 四、包埋法 包埋法是細胞固定化最常用 的方法。吸附法可分為物理吸附和離子吸附兩種。 四、固定化細胞的分類 1，按固定的細胞類型不同分為三類： （ 1）微生物； （ 2）動物； （ 3）植物。 二、固定化細胞的優(yōu)點 1，與游離細胞相比 與游離細胞發(fā)酵相比，固定化細胞發(fā)酵具有以下優(yōu)點： （ 1）固定化細胞可以將微生物發(fā)酵改為連續(xù)酶反應 （ 2）可以獲得更高的細胞濃度； （ 3）細胞可以重復使 用； （ 4）在高稀釋率時，不會產生洗脫現象； （ 5）單位容積的產率高； （ 6）提高遺傳穩(wěn)定性； （ 7）細胞不會受到剪切效應的影響。 第二節(jié) 細胞固定化的方法 細胞固定化方法有： Adsorption（吸附）； covalent bonding（共價結合）；Cross linking（交聯）； Entrapment（包埋）、 Encapsulation（微膠囊） 。 三、交聯法 利用雙功能或多功能試劑與細胞表面的反應基團（如氨基、羧基、羥基、巰基、咪唑基）反應，從而使細胞固定。 共價法：操作穩(wěn)定性高。如，用聚丙烯酰胺包埋的大腸桿菌中的天門冬氨酸酶和產氨短桿菌中的延胡索酸酶的最適 pH 向酸性范圍偏移?？股氐陌l(fā)酵為非生長關聯型，因此生長和代謝產物合成階段所需的營養(yǎng)條件不同。這一過程可以連續(xù)化操作。固定化細胞能利用這些物質生長并使之完全降解。因此固定化生長細胞可被看成是一個免受 P細胞競爭的細胞 庫。 基因工程的核心技術是 DNA 的重組技術。內森斯博士和漢密爾 1974 年以后，科學界正式肯定了這一發(fā)現，并把這種酶叫作 DNA 連接酶。例如我們用一種經過改造的抗四環(huán)素質粒 PSC100 作載體，將一種基因移入自身無抗性的大腸桿菌時，如果基因移入后大腸桿菌不能被四環(huán)素殺死，就說明轉入獲得成功了。根據選擇性標記，從菌落中篩選出目的基因的重組 (工程 )菌。 第二節(jié) 工程菌的培養(yǎng) 就生產流程而言，從發(fā)酵到分離、純化目標產物，工程菌和常規(guī)微生物并無太多的差異。其目的是保證實驗的安全和推動重組 DNA 的研究。 LS2 相當嚴格，工業(yè)生產起碼應在 LS1 的設備標 準下培養(yǎng)。因此，基因工程細胞培養(yǎng)過程，重組 DNA 的丟失方式亦有兩種，其一是細胞培養(yǎng)過程，由于回復突變或分配作用致使 DNA 丟失．稱為脫落性不穩(wěn)定，其二是重組 DNA 中編碼的結構基因在宿主內發(fā)生再重組過程產生突變，不再表達目的產物，此稱加結構性不穩(wěn)定。 目前關于動植物基因工程細胞培養(yǎng)工程的研究剛剛起步，有待進 — 步發(fā)展。但菌體對葡萄糖及氨基酸的收率因培養(yǎng)條件而異，如以葡萄糖及分別用蘇氨酸、亮氨酸、組氨酸及色氨酸為底物時，則平均每克底物所獲干菌體量分別為 、 、 1 40 及 40g 。 為考察質粒穩(wěn)定性，在此引入質粒保持率 Fn的概念， Fn表示分批培養(yǎng)中細胞分裂 n次后，培養(yǎng)液中基因工程細胞數與總細胞數的 比值，即 假定在分批培養(yǎng)過程中，細胞在對數生長期每次分裂時，其質粒丟失率為 P，則 Fn為： 式中 α 質粒丟失菌株與質粒保持率菌株 μ 的比值； n細胞分裂次數 理論上基因工程菌載荷外源性基因，培養(yǎng)過程細胞大量合成外源性產物，其負荷大于質粒丟失菌株，故基因工程菌株比生長速率 μ 通常較質拉丟失菌株小，當然亦有變化不大者。在工業(yè)生產中易于操作的方法是在培養(yǎng)的不同階段，采用不同培養(yǎng)溫度達到提高拷貝數目的，在前培養(yǎng)階段采用低溫，以減少細胞負荷，此時拷貝數較低，而比生長速率升高，在主培養(yǎng)中途升高溫度，質粒拷貝數增加，目的基因產量提高。 由此可知，在基因工程細胞培養(yǎng)工程中，需根據其固有特點和具體情況，采取相應措施、提高質粒穩(wěn)定性，增加質?？截悢?，實現培養(yǎng)條件優(yōu)化，提高表達效率。前者是可移動的臺式，罐本身不能承受高壓；后者，蒸汽、空氣等供給是用固定管道連接的，一般不能移動；這兩類罐要充分考慮不使微生物由罐外進入罐內的問題，但并不一定要解決防止罐內微生物的外漏問題。它們從排氣口向外排出，重組菌也容易隨之外漏。氣體通過排氣管到鼓泡瓶，再通過膜濾器。表中數字為培養(yǎng)開始啟 12h 中在膜濾器上捕集到的活菌數。C。 2，機械密封 通氣攪拌培養(yǎng)罐中貫穿罐的攪拌軸須與傳動部連接。所以單機械密封的培養(yǎng)罐不宜用于基因重組菌的培養(yǎng)。 10L 以下的培養(yǎng)裝置以往一直是用磁力進行動力傳動的，但罐一大，會出現磁力不足、軸承磨損等問題。取完所需的樣品，卸下之前對取樣管道再次滅菌。取樣方法與人工取