【正文】 105:149151. VS , Parilak LD, Kerensky RA. Angiographic paterns and the natural history of the vulnerable plaque. Prog Cardiovasc Dis. 2002。 Hiroyuki Kusano, MD。特別感謝孫鑫師兄、郭淑媛師姐、陳海波師兄在課題設(shè)計(jì)和實(shí)驗(yàn)過(guò)程中給予的悉心指導(dǎo)和無(wú)私幫助，在實(shí)驗(yàn)方面的大力支持，在實(shí)驗(yàn)中給予的意見(jiàn)和建議，使我們受到很大的啟發(fā)，為實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行打下了良好的基礎(chǔ)。取SDT后20min、對(duì)照組、zVADfmk組及SDTzVAd 組細(xì)胞上清及細(xì)胞裂解液，分別加入配置好的ATP檢測(cè)工作液當(dāng)中，反應(yīng)10s后使用luminometer分別檢測(cè)細(xì)胞上清液及胞內(nèi)ATP含量。目前有研究表明，凋亡細(xì)胞釋放的核苷酸可以作為一種“findme”信號(hào)參與對(duì)單核性吞噬細(xì)胞的募集[13]。技術(shù)路線(xiàn)THP1巨噬細(xì)胞細(xì)胞裂解產(chǎn)物螢火蟲(chóng)熒光素酶細(xì)胞上清液LuminometerSDT組SDT zVAD組對(duì)照組THP1 巨噬細(xì)胞對(duì)照組 SDT ATPase組 ATPaseATPase細(xì)胞上清液 ATP酶組SDT組Transwell zVADfmk組結(jié) 果1. 培養(yǎng)THP1單核細(xì)胞并將其誘導(dǎo)為巨噬細(xì)胞，見(jiàn)圖3 A B圖3 A THP1單核細(xì)胞 B 巨噬細(xì)胞 （200X） 2. Transwell方法測(cè)定細(xì)胞上清液對(duì)單核細(xì)胞趨化作用，見(jiàn)圖4 A B C圖4 A Transwell實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ綀D B 用光學(xué)顯微鏡觀(guān)察募集的臺(tái)盼藍(lán)染色后的單核細(xì)胞，并計(jì)數(shù) C 細(xì)胞遷移數(shù) （***：P。將培養(yǎng)基保存在37℃、含5%CO2和95%空氣的保濕孵育器內(nèi)，當(dāng)發(fā)生聚集時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡之前加入caspase抑制劑zVADfmk后所取上清液不能夠誘導(dǎo)單核細(xì)胞聚集，證明凋亡細(xì)胞釋放的ATP依賴(lài)于caspase途徑并受其調(diào)節(jié)[13]。 乳酸能系統(tǒng)是持續(xù)進(jìn)行劇烈運(yùn)動(dòng)時(shí)，肌肉內(nèi)的肌糖元在缺氧狀態(tài)下進(jìn)行酵解， 經(jīng)過(guò)一系列化學(xué)反應(yīng)，最終在體內(nèi)產(chǎn)生乳酸，同時(shí)釋放能量供肌肉收縮。ATP不能被儲(chǔ)存，因?yàn)锳TP的合成后必須在短時(shí)間內(nèi)被消耗。2002年Arakawa K等研究了聲動(dòng)力治療用于兔股動(dòng)脈置入支架后再狹窄預(yù)防作用[19]，而聲動(dòng)力治療對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的作用的研究目前國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)報(bào)道。分子式為C5H9NO3超聲過(guò)程中超聲空化導(dǎo)致聲致發(fā)光，光激活空化泡內(nèi)或臨近的光敏劑分子而產(chǎn)生單線(xiàn)態(tài)氧。 2. 聲動(dòng)力治療 1989年國(guó)際超聲學(xué)會(huì)議上，日本學(xué)者Umemura S首次提出了SDT這一概念。在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中發(fā)現(xiàn)血管平滑肌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞都經(jīng)歷著凋亡與壞死，而凋亡占主導(dǎo)地位。粥樣壞死中心的形成與泡沫細(xì)胞的聚集和凋亡密切相關(guān)。這一發(fā)現(xiàn)，為臨床治療AS提供了理論依據(jù)及研發(fā)新藥提供了新思路。其中對(duì)照組為單純THP1源性巨噬細(xì)胞，SDT組是在對(duì)照組基礎(chǔ)上加入 ALA，孵育2小時(shí)后接受聲動(dòng)力治療。其中對(duì)照組為單純THP1源性巨噬細(xì)胞，而SDT組是在對(duì)照組基礎(chǔ)上加入終濃度為15μg/ml的5氨基酮戊酸（5Aminolevulinic acid, ALA），孵育2小時(shí)后接受聲動(dòng)力治療。既往和晚近提出的AS發(fā)病學(xué)說(shuō)，如血栓形成學(xué)說(shuō)、脂質(zhì)浸潤(rùn)學(xué)說(shuō)、單克隆學(xué)說(shuō)、損傷反應(yīng)學(xué)說(shuō)、剪切應(yīng)力學(xué)說(shuō)、同型半胱氨酸學(xué)說(shuō)、精氨酸學(xué)說(shuō)、內(nèi)皮功能紊亂學(xué)說(shuō)、氧化應(yīng)激學(xué)說(shuō)等都不足以完全解釋AS的發(fā)病基礎(chǔ)[1]。巨噬細(xì)胞的吞噬作用在動(dòng)脈粥樣硬化不同的病變階段有著很大的差異，所以在病變?cè)缙诤屯砥谄涞蛲鰧?duì)動(dòng)脈粥樣硬化的影響是不同的。斑塊中細(xì)胞大量凋亡不僅直接造成脂質(zhì)中細(xì)胞數(shù)量的減少，而且由于巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞凋亡后形成的凋亡物質(zhì)難以清除，發(fā)生繼發(fā)性壞死和炎癥反應(yīng)，細(xì)胞膜完整性破壞，脂質(zhì)為主的胞漿內(nèi)容物釋放后堆積形成脂質(zhì)池，從而促進(jìn)斑塊脂質(zhì)中心的形成并逐漸增大。動(dòng)脈粥樣硬化是多因素作用的復(fù)雜病變，在其發(fā)生發(fā)展中巨噬細(xì)胞有著重要的作用，抑制巨噬細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)聚集、減輕炎癥反應(yīng)，以及選擇性調(diào)控其凋亡程序?qū)⒊蔀閯?dòng)脈粥樣硬化新的有效的治療手段。 自由基理論認(rèn)為由于超聲的空化作用激活空化泡內(nèi)或臨近的光敏劑，通過(guò)直接熱分解弱鍵或與水熱分解形成的ALA 屬于第二代光敏劑。PpⅨ是一種非常有效的光敏劑，它在一定波長(zhǎng)的光照射下，發(fā)生化學(xué)反應(yīng)， 產(chǎn)生單重態(tài)氧和氧化物， 引起細(xì)胞膜、線(xiàn)粒體和核酸的損傷，使病變細(xì)胞壞死、凋亡，從而起到治療疾病的作用[17]。人體每天的能量需要水解100150摩爾的ATP即相當(dāng)于50至75千克。 ①非乳酸能（ATP—CP）系統(tǒng)—一般可維持10秒肌肉活動(dòng) 無(wú)氧代謝 ②乳酸能系統(tǒng)—一般可維持1~3分的肌肉活動(dòng) 非乳酸能（ATP—CP）系統(tǒng)和乳酸能系統(tǒng)是從事短時(shí)間、 劇烈運(yùn)動(dòng)肌肉供能的主要方式。這些信號(hào)包括溶血磷脂酰膽堿、趨化因子、ATP、UTP、S1p等等。本研究驗(yàn)證了聲動(dòng)力治療巨噬細(xì)胞能夠趨化單核細(xì)胞，并探討了ATP在趨化過(guò)程中的作用，對(duì)聲動(dòng)力治療動(dòng)脈粥樣硬化的機(jī)制進(jìn)行了有益的探索，并為動(dòng)脈粥樣硬化的治療提示了一個(gè)可能的新方向。zVAdfmk 組細(xì)胞上清及細(xì)胞裂解液，分別加入配置好的ATP檢測(cè)工作液當(dāng)中，反應(yīng)10s后使用luminometer分別檢測(cè)細(xì)胞上清液及胞內(nèi)ATP含量。巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致易損斑塊破裂的主要因素[22]，因此在動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展中對(duì)巨噬細(xì)胞積極性干預(yù)，對(duì)于預(yù)防急性心血管事件的發(fā)生具有非常重要的臨床意義。此實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)聲動(dòng)力治療后的凋亡巨噬細(xì)胞能夠趨化單核細(xì)胞的聚集。2. 聲動(dòng)力治療巨噬細(xì)胞后ATP釋放增加依賴(lài)于caspase途徑的凋亡。 Kodi S. Ravichandran， Nucleotides released by apoptotic cells act as a findme signal to promote phagocytic clearance[J]. Nature,2009,461:282287.14. Misik V , Riesz P. Free radical intermediates in sonodynamic therapy [J] . Annals of the New York Academy of Sciences , 2000 ,899 : 335348. L,Sostaric JZ,Piesz therapya review of the synergistic effects of drugs and ultrasound[J]. Ultrason. Sonochem.,2004,11:349363. T, Kijima M, Yokoyama R, Shindo J, Nagata K, Hirosaka A, Techigawara M, Abe Y, Sato E, Yamaguchi N, Watanabe N, Saito T, Maehara K, Ohmoto Y, Maruyama Y. Expression of cytokine and adhesion molecule mRNA in atherectomy specimens from patients with coro