重組人b淋巴細胞刺激因子工程菌高密度發(fā)酵(編輯修改稿)
2025-07-26 05:01 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 出一管，以保證菌種的穩(wěn)定性。未誘導菌液可作為活化種子保存于4℃。. 2 搖瓶培養(yǎng) 2%活化種子接種于含150 ml 2YT的500 ml搖瓶中，37℃，200 r/min振搖培養(yǎng)至對數(shù)中期，加入IPTG誘導或作為5 L發(fā)酵罐的菌種。1. 2. 3 5L自控發(fā)酵罐中分批補料培養(yǎng) 取三角瓶種子液按3%接種入發(fā)酵罐?？刂茀?shù)為溶氧及轉(zhuǎn)速：溶氧控制在30%～50%，達到最大轉(zhuǎn)速800 r/min后, 自動通入純氧。溫度控制為37℃。，當pH低于該值時，通過流加30%的氨水來保持恒定。補料流加方案為發(fā)酵過程中0～6 h不加補料，6～8 h補料流速設定為50 ml/ h, 8～10 h補料流速設定為100 ml/h 。1. 2. 4 重組BLyS表達量測定按常規(guī)SDSPAGE檢測，灰度掃描儀分析重組蛋白占菌體總蛋白的百分含量。1. 2. 5 菌體濃度測量 采用稱重法和濃度法，A600 nm吸收值與細胞干重呈線性。一個單位的A600約為干菌0. 4 g/L。1. 2. 6 菌體總蛋白測定 Bradford法測菌體總蛋白，總平均值為0. 525 g/g (蛋白/干菌體) [6]。2 結(jié) 果2. 1 試管培養(yǎng)及條件優(yōu)化2. 1. 1 試管培養(yǎng)中誘導表達時間的優(yōu)化 試管培養(yǎng)至對數(shù)中期(A600 =), mmol/ L IPTG誘導重組蛋白的表達， h取樣一次，SDSPAGE分析表達情況。結(jié)果表明誘導1 h后外源蛋白即開始表達，表達水平在3 h內(nèi)迅速提高，4 h達到高峰，5 h后開始下降，菌體密度也有所降低。由此確定發(fā)酵結(jié)束時間可以在誘導后4～5 h，控制在菌體密度開始下降前。 1 2 3 4 5 6 工程菌發(fā)酵的菌體生長曲線和目的蛋白表達水平。1: 未誘導菌體總蛋白。 2: 誘導1小時菌體總蛋白。 3: 誘導2小時菌體總蛋白。 4: 誘導3小時菌體總蛋白。 5: 誘導4小時菌體總蛋白。 6: 誘導5小時菌體總蛋白.2. 1. 2 IPTG濃度對重組蛋白表達水平的影響試管培養(yǎng)至A600 =，加入IPTG至0. 00. 00. 0、 mmol/L終濃度，誘導表達4 h， A600，取樣用SDSPAGE檢測。 mmol/L IPTG即有誘導外源蛋白表達的能力，~2 mmol/L時，IPTG誘導濃度對目的蛋白質(zhì)的表達水平?jīng)]有顯著性影響。 mmol/L IPTG誘導菌體濃度為25 A600左右的菌體表達，取得了良好的結(jié)果。1 2 3 4 5 6 7 8 9 不同濃度IPTG誘導劑對于TTBLyS蛋白質(zhì)表達水平的影響 1: 未誘導菌體總蛋白。 29: 、、1和2 mmol/L IPTG誘導后菌體總蛋白.2. 2 三角瓶培養(yǎng)中誘導時機對細菌生長和蛋白表達的影響利用特制的通氣良好的三角瓶進行培養(yǎng)，在細菌生長的對數(shù)早、中、晚期(分別培養(yǎng)4 h、6 h、8 h) mmol/ L IPTG進行表達4 h，結(jié)果表明在中期誘導不僅最終菌體密度較高，重組蛋白的產(chǎn)量也較其它各期更高。如在早期誘導，雖然表達量比較高，但是由于誘導劑的抑制效果收菌量明顯下降；在晚期進行誘導，盡管誘導時菌體密度更高，但誘導后
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