固定化酶ppt課件(2)(編輯修改稿)
2025-02-01 09:04 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 ，制成固定化酶，交聯(lián)時(shí)的 pH通常與酶的 pI相同。 ? 交聯(lián)法常與吸附法結(jié)合使用，或者與包埋法配合，目的是使酶緊緊地結(jié)合于載體上。 酶直接交聯(lián)法 在酶液中加入適量多功能試劑，使其形成不溶性衍生物。 固定化依賴于酶與試劑的濃度、溶液 pH和離子強(qiáng)度、溫度和反應(yīng)時(shí)間之間的平衡。 例：木瓜蛋白酶在 ％酶蛋白濃度、 ％戊二醛、 、 0℃ 下交聯(lián) 24h，可形成固定化酶。 固定化酶制備方法比較 物理吸附 離子結(jié)合 包埋法 交聯(lián)法 共價(jià) 結(jié)合 法 制備 易 易 難 難 結(jié)合力 弱 強(qiáng) 強(qiáng) 強(qiáng) 酶活力 高 高 中 中 底物專一性 無(wú)變化 無(wú)變化 有變化 有變化 再生 可能 不可能 不可能 不可能 固定化費(fèi)用 低 中 中 高 制法 特性 定向固定化 ?由于酶蛋白多點(diǎn)附著在載體上，引起了固定化酶蛋白無(wú)序的定向和結(jié)構(gòu)變形的增加。 ?定向固定化技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)： (1)每一個(gè)酶蛋白分子通過(guò)其一個(gè)特定的位點(diǎn)以可重復(fù)的方式進(jìn)行固定化 。 (2) 有利于進(jìn)一步研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu) 。 (3) 可以借助一個(gè)與酶蛋白的酶活性無(wú)關(guān)或影響很小的氨基酸來(lái)實(shí)現(xiàn)。 定向固定化方法 ① 酶和抗體的親和連接 ② 酶通過(guò)糖基部分固定化 ③ 酶和金屬離子連接 ④ 分子生物學(xué)方法 基因融合法 翻譯后修飾法 特定位點(diǎn)基因突變法 第二節(jié) 輔酶的固定方法 ? 原因 ? 約 1／ 3的酶的催化作用得以進(jìn)行需要輔酶的參與，缺少它們，酶就不能表達(dá)其活性 。 ? 在工業(yè)上應(yīng)用全酶的關(guān)鍵是有機(jī)輔因子的保留和再生，因?yàn)樵诜磻?yīng)之后，大多數(shù)有機(jī)輔因子不能自行再生，其結(jié)構(gòu)往往發(fā)生改變。 ? 有機(jī)輔因子價(jià)格昂貴 ? 輔基 —— 容易回收 ? 與酶蛋白結(jié)合比較牢固，通?？梢杂贸瑸V膜截留等物理方法進(jìn)行回收。 ? 輔酶 —— 回收再生困難 ? 輔酶分子量小，難以截留再生。 ? 將其與水溶性大分子載體或水不溶性載體結(jié)合 ? 過(guò)程 : 將活化的載體與連接臂連接，再以適當(dāng)反應(yīng)與輔基連接。 連接臂 活化載體 輔基 功能基團(tuán) 載體的選擇 ? 沒(méi)有特異性吸附 ? 具有多孔性 ? 有適合引入配基的官能團(tuán) ? 化學(xué)穩(wěn)定性 ? 具有適當(dāng)?shù)臋C(jī)械強(qiáng)度等。 ? 目前使用的載體主要是 瓊脂糖 ，此外還有纖維素、玻璃珠及合成高分子材料等。 連接臂的選擇 需考慮的因素 : ? 輔基的性質(zhì) : 疏水性、親水性、離子性 、 體積大小 ? 長(zhǎng)度 : 輔基分子和載體之間需要 nm 長(zhǎng)的手臂。用較長(zhǎng) 的疏 水烷基作手臀時(shí)，由于亦有吸附強(qiáng)的能力、會(huì)使固定化輔基吸附專一性降低。 偶聯(lián)反應(yīng)的選擇 ? 利用輔基分子本身的功能基團(tuán)與載體連接 如磷酸吡哆醛 (胺 )、 FAD、 FMN、 TPP、生物素、硫辛酸、卟啉等 ? 引入適當(dāng)?shù)墓δ芑鶊F(tuán) — 不能影響輔基的活性 如 羧基 或 氨基 等 酶 的固定化 ? 載體共價(jià)偶聯(lián)： 與 輔基的固定化方法相似 ? 或：修飾后置于超濾器 ? 引入一個(gè)功能基團(tuán)，生成輔酶的衍生物 —— 羧基或氨基 ? 衍生物再與 水溶性高分子聚合物 結(jié)合。 選擇高分子化 時(shí)，要考慮的是高分子化合物的溶解度大、分子大小適當(dāng)，既能保持在半透膜內(nèi)，又不會(huì)過(guò)大地增加黏度而影響活性 。 必須將 輔酶 固定在 水溶性載體 上 ? 輔酶 分子量小，難以截留再生，非常致密的超濾膜才能阻止它的流失，這樣勢(shì)必增加流體的流動(dòng)阻力，降低反應(yīng)產(chǎn)率。 ? 輔酶 分子量小，要將其包埋在半透膜比較困難； ? 若將其與水不溶性載體結(jié)合，則不能在多個(gè)酶之間起傳遞作用，酶反應(yīng)存在較大的擴(kuò)散阻力，酶的表觀活力降低，輔酶再生效率降低。 ? 一般引入 羧基 的輔酶，用 羰二亞胺 縮合反應(yīng)使其與 聚 Lys、聚乙亞胺 結(jié)合，形成水溶性高分子化合物； ? 引入 氨基 的輔酶，一般用 BrCN活化后，再與水溶性多糖類 (如 右旋糖苷 )結(jié)合，而高分子化。 輔酶的再生 ? 除了將輔酶固定在水溶性載體上之外，還需要有一個(gè)適宜的超濾膜反應(yīng)器或中空纖維反應(yīng)器來(lái)截留固定化輔酶和酶。 ? 原位再生 —— 將輔因子始終截留在反應(yīng)體系，通過(guò)氧化還原等反應(yīng)實(shí)現(xiàn)輔因子再生。 輔因子再生 —— 偶合另一種酶（如醇脫氫酶） 第三節(jié) 固定化細(xì)胞 （ Immobilized Cell） ? 固定化細(xì)胞 ： 固定在載體上并在一定的空間范圍內(nèi)進(jìn)行生命活動(dòng)的細(xì)胞。該細(xì)胞能進(jìn)行正常的生長(zhǎng)、繁殖和新陳代謝，又稱固定化活細(xì)胞或固定化增殖細(xì)胞。 ? 固定化 細(xì)胞仍保留催化活性并具有能被反復(fù)或連續(xù)使用的活力。 固定化細(xì)胞的優(yōu)缺點(diǎn) ? 優(yōu)點(diǎn)： (1)省去了酶的分離手續(xù)，為多酶系統(tǒng)， 無(wú)須輔因子再生 。 (2)細(xì)胞生長(zhǎng)快且多、反應(yīng)快 (3)可以連續(xù)發(fā)酵，節(jié)約成本，而且在蒸餾和提取前不用分離去細(xì)胞，能一邊排出發(fā)酵液，一邊進(jìn)行培養(yǎng)，排除了產(chǎn)物抑制和消耗。 (4)保持酶在細(xì)胞內(nèi)的原始狀況，增加了酶的穩(wěn)定 性 ，特別是對(duì)污染因子的抵抗力增加。 ? 缺點(diǎn)： (1)必須保持菌體的完整，防止菌體自溶
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