《聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)》ppt課件-文庫(kù)吧
2024-12-21 16:46 本頁(yè)面
【正文】 性 延伸 變性 95oC 5min 50oC 1min 72oC 2min 94oC 1min 溫度循環(huán) 需要的模板量極低。 PCR的特點(diǎn) （ 1）特異性強(qiáng) ① PCR使用專門合成的 DNA引物。 ② 延伸過(guò)程是在高溫下進(jìn)行。 （ 2）敏感性高 這就避免了一般 DNA聚合酶污染和非引物延伸形成的 DNA。提高了反映的特異性。 理論上只要一條模板鏈， 32次循環(huán)就可合成約 109條！ RTPCR： 對(duì)模板的純度要求低。 （ 5）可以擴(kuò)增 mRNA （ 4）簡(jiǎn)便 先用逆轉(zhuǎn)錄酶將 mRNA合成 cDNA，再以 cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增。 （ 3）快速 整個(gè) PCR過(guò)程約 4小時(shí)即可完成。 不需要純化，甚至可以直接用細(xì)菌。已固定或包埋的組織切片也可以直接用于作模板。 標(biāo)準(zhǔn)的 PCR反應(yīng)體系 10 擴(kuò)增緩沖液 10ul 4種 dNTP混合物 各 200umol/L 引物 10～ 100pmol 模板 DNA ～ 2ug Taq DNA聚合酶 Mg2+ 加雙或三蒸水至 100ul 自從 . Erilish分離出耐高溫的 Taq DNA聚合酶，代替大腸桿菌 DNA聚合酶 Klenow片斷（ 37 oC )， PCR技術(shù)才進(jìn)入實(shí)用階段。 （ 1） Taq DNA聚合酶 影響 PCR的因素 Taq DNA聚合酶的最大特點(diǎn)是熱穩(wěn)定性，耐高溫，非常適合 PCR過(guò)程的反復(fù)高溫變性要求。 ① 熱穩(wěn)定性 最適溫度： 7278 oC 延伸速度： 約 1000nt/min酶分子 最長(zhǎng)延伸長(zhǎng)度： ② 最適溫度高 ③ Taq酶的功能缺點(diǎn) 具有 5’?3’聚合酶活性和 5’?3’外切酶活性，但沒(méi)有 3‘?5’外切酶活性。 合成超過(guò) 600bp長(zhǎng)度的 DNA就有可能出現(xiàn)錯(cuò)配，用于克隆基因時(shí)必須測(cè)序。 金屬離子敏感（尤其是 Mg2+ ）。 當(dāng) dNTP（能結(jié)合 Mg2+）的濃度為 ， MgCl2的最佳濃度應(yīng)是。 ④ Taq DNA聚合酶的激活劑 50mmol/L KCl也能激活 Taq DNA聚合酶的活性。 與待擴(kuò)增的模板 DNA區(qū)段的兩 3’端序列互補(bǔ)（ 5‘端相同）的短 DNA。 （ 2）引物（ primer) ①位置 3’ 3’ 即 ?1011 bp的基因組中有一次完全與 19個(gè)核苷酸的序列相同的機(jī)會(huì)（或機(jī)會(huì)是約 2 1011）。 ②引物的長(zhǎng)度 理論計(jì)算： 419=?1011。 一般引物設(shè)計(jì)為長(zhǎng) 15— 30bp。 ③引物的堿基序列 5’端根據(jù)需要可設(shè)計(jì)成某個(gè)內(nèi)切酶的切點(diǎn)順序、 RNA聚合酶識(shí)別序列、突變位點(diǎn)或生物素標(biāo)記等，方便與以后操作。 5’ATGCAGAAACTGATCGATCGATCGAT3’ 3’GCTAGCTACTTAAG5’ 3‘端必須與模板正確配對(duì)， 5’端可以不配對(duì)。 template primer 盡可能提高 G+C含量，以提高引物與模板的結(jié)合力 ④引物的堿基組成 避免連續(xù)相同堿基排列或內(nèi)部回文序列 . 5’GGCAGTCTGCCAGTCTAC3’ CTGCCAGTCTAC3’ GACGG5’ T 發(fā)卡結(jié)構(gòu) 1） 2） 3） 避免形成引物二聚體（ dimer） 兩個(gè)引物之間不能有兩個(gè)以上
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