電泳技術(shù)及其在分子生物學(xué)中的應(yīng)用-閱讀頁
2025-01-31 19:44本頁面
【正文】 sm ， RFLP)。 蛋白質(zhì)在一定濃度的含有強(qiáng)還原劑的 SDS溶液中，與SDS分子按比例結(jié)合 (多肽和 SDS的質(zhì)量比為 1:)，形成帶負(fù)電荷的 SDS蛋白質(zhì)復(fù)合物，所帶的負(fù)電荷大大超過了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，從而消除了不同分子之間原有的電荷差異 。 因此 ， 蛋白質(zhì) SDS復(fù)合物在 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳系統(tǒng)中的遷移率不再受蛋白質(zhì)原有電荷的影響 ， 而主要取決于橢圓棒的長(zhǎng)軸長(zhǎng)度 ， 即蛋白質(zhì)亞基分子量的大小 。 特點(diǎn) ?大多在 不連續(xù)緩沖體系 中進(jìn)行，其電泳槽緩沖液的 pH值與離子強(qiáng)度不同于配膠緩沖液； ?不連續(xù)緩沖體系具有把樣品中的復(fù)合物全部濃縮于極小體積的能力，故提高了 SDSPAGE的分辨力； ?系統(tǒng)中所有組分都含有 %的 SDS。 TwoDimensional SDSPAGE PI (by isoelectric focusing – IEF) Approximate mol wt. (by SDS PAGE) Example of 2DGel Separation of Proteins 2D gels are ideal tools of protein separation because of their high resolution (1000 spots are monly visualized on a single gel) and visual readout Western blotting 印跡法（ blotting）是指將樣品轉(zhuǎn)移到固相載體上，而后利用相應(yīng)的探測(cè)反應(yīng)來檢測(cè)樣品的一種方法。 對(duì) RNA的印跡分析稱為 Northern印跡法 . 對(duì)單向電泳后的蛋白質(zhì)分子的印跡分析稱為Western印跡法 。 1）蛋白提取 2） SDSPAGE 3）轉(zhuǎn)膜 4）封閉 5）一抗作用 6）標(biāo)記二抗作用 7）結(jié)果檢測(cè) Western blotting 基本步驟： 轉(zhuǎn)膜 將凝膠和固相基質(zhì)象三明治一樣加在用緩沖液濕潤(rùn)濾紙之間。 倒掉一抗溶液，用 PBST(或 TBST)漂洗液濾膜 3次，每次 10min。 倒掉二抗溶液，用 PBST (或 TBST)漂洗液濾膜 3次，每次 10m
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