電泳技術(shù)及其在分子生物學(xué)中的應(yīng)用(編輯修改稿)
2025-02-12 19:44 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 交聯(lián)劑， N， N39。一亞甲雙丙烯酰胺參與下，聚丙烯胺鏈與鏈之間交叉聯(lián)接而形成凝膠 . 與瓊脂糖凝膠電泳的比較 , PAGE的特點(diǎn) ?分辨率很強(qiáng)，長(zhǎng)度上相差 1bp的 DNA即可分開(kāi)； ?從聚丙烯酰胺凝膠中回收的 DNA純度很高，可適用于要求最高的實(shí)驗(yàn)（如胚胎注射）； ?裝載更多的 DNA量； ?最適合分離小片段 DNA(5500bp),可以分離 蛋白質(zhì) 。 ?聚丙烯酰胺凝膠一律進(jìn)行垂直電泳 . 假如 DNA 順序中的某個(gè)堿基發(fā)生了突變，使突變所在部位的 DNA 序列產(chǎn)生（或缺失）某種限制性內(nèi)切酶的位點(diǎn)。這樣，利用該限制性內(nèi)切酶消化此 DNA 時(shí)，便會(huì)產(chǎn)生與正常不同的限制性片段。這樣，在同種生物的不同個(gè)體中會(huì)出現(xiàn)不同長(zhǎng)度的限制性片段類型，即限制性片段多態(tài)性 (Restriction Fragment Length Polymorphism ， RFLP)。 限制性片段多態(tài)性 (RFLP) 點(diǎn)多態(tài)性實(shí)驗(yàn)方法 SDS聚丙烯酰胺凝膠 電泳 （ SDSPAGE） 的原理 在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中引進(jìn) SDS（十二烷基磺酸鈉）， SDS能斷裂分子內(nèi)和分子間氫鍵，破壞蛋白質(zhì)的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，同時(shí)，在強(qiáng)還原劑（ beta巰基乙醇）作用下，使半胱氨酸之間的二硫鍵斷裂。 蛋白質(zhì)在一定濃度的含有強(qiáng)還原劑的 SDS溶液中，與SDS分子按比例結(jié)合 (多肽和 SDS的質(zhì)量比為 1:)，形成帶負(fù)電荷的 SDS蛋白質(zhì)復(fù)合物，所帶的負(fù)電荷大大超過(guò)了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，從而消除了不同分子之間原有的電荷差異 。 蛋白質(zhì) SDS復(fù)合物的形狀近似于長(zhǎng)的橢圓棒，它們的短軸是恒定的，而長(zhǎng)軸與蛋白質(zhì)分子量的大小成比例。 因此 ， 蛋白質(zhì) SDS復(fù)合物在 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳系統(tǒng)中的遷移率不再受蛋白質(zhì)原有電荷的影響 ， 而主要取決于橢圓棒的長(zhǎng)軸長(zhǎng)度 ， 即蛋白質(zhì)亞基分子量的大小 。 當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)分子量在 15KD到 200KD之間時(shí) ， 電泳遷移率與分子量的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系 。 特點(diǎn) ?大多在 不連續(xù)緩沖體系 中進(jìn)行，其電泳槽緩沖液的 pH值與離子強(qiáng)度不同于配膠緩沖液； ?不連續(xù)緩沖體系具有把樣品中的復(fù)合物
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