分子生物學的基本操作(編輯修改稿)
2025-02-09 07:57 本頁面
【文章內容簡介】 間的關系。 基因擴增 聚合酶鏈式反應 (polymerase chain reaction)，即 PCR技術，是一種在體外快速擴增特定基因或 DNA序列的方法，故又稱為基因的體外擴增法。 基本原理 PCR技術的基本原理類似于 DNA的天然復制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。 PCR由高溫變性 — 低溫退火 — 適溫延伸三個基本反應步驟構成，經(jīng)多個循環(huán)，理論上靶 DNA分子將呈現(xiàn)指數(shù)性擴增。 PCR Cycle Step 1 Denaturation Template DNA by Heat (95oC) Target Sequence Target Sequence PCR原理示意圖 ①模板 DNA的變性：模板 DNA經(jīng)加熱至 93℃ 左右一定時間后，使模板 DNA雙鏈或經(jīng) PCR擴增形成的雙鏈 DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備； PCR Cycle Step 2 – Temperature is lowered (Tm ) and primers anneal to target sequences ②模板 DNA與引物的退火 (復性 )：模板 DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至 55℃ 左右，引物與模板 DNA單鏈的互補序列配對結合； PCR Cycle Step 3 At 72 o C Taq DNA polymerase catalyses primer extension as plementary nucleotides are incorporated ③引物的延伸：DNA模板 引物結合物在 TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的互補 鏈。 End of the 1st PCR Cycle – Results in two copies of target sequence 每完成一個循環(huán)需 2～ 4分鐘， 2～ 3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。 Target Amplification No. of No. Amplicon Cycles Copies of Target 1 2 2 4 3 8 4 16 5 32 6 64 20 1,048,576 30 1,073,741,824 1 cycle = 2 Amplicon 2 cycle = 4 Amplicon 3 cycle = 8 Amplicon 4 cycle = 16 Amplicon 5 cycle = 32 Amplicon 6 cycle = 64 Amplicon 7 cycle = 128 Amplicon PCR儀 核酸的凝膠電泳 自從瓊脂糖 （ agarose） 和聚丙烯酰胺（ polyacrylamide） 凝膠被引入核酸研究以來，按分子量大小分離 DNA的凝膠電泳技術，已經(jīng)發(fā)展成為一種分析鑒定重組 DNA分子及蛋白質與核酸相互作用的重要實驗手段，也是現(xiàn)在通用的許多分子生物學研究方法，如： DNA分型、 DNA核 苷酸序列分析、限制性內切酶片段分析以及限制酶切作圖等的技術基礎，受到科學界的高度重視。 基本原理 一種分子被放置到電場中，它就會以一定的速度移向適當?shù)碾姌O。 電泳分子在電場作用下的遷移速度，叫做電泳的 遷移率 ，它與電場強度和電泳分子本身所攜帶的凈電荷數(shù)成正比，與分子同介質的摩擦系數(shù)成反比。 已知摩擦系數(shù)是分子大小、極性及介質粘度的函數(shù)，因此，根據(jù)分子大小的不同、構型或形狀的差異以及所帶的凈電荷的多寡，便可以通過電泳將蛋白質或核酸分子混合物中的各種成分彼此分離開來。 在生理條件下，核酸分子之糖 磷酸骨架中的磷酸基團，是呈離子化狀態(tài)的，所以， DNA和 RNA多核苷酸鏈又被稱為多聚陰離子（ polyanions）， 把這些核酸分子放置在電場當中，它們就會向正電極的方向遷移。 在一定的電場強度下， DNA分子的這種遷移速度，亦即電泳的遷移率，取決于核酸分子本身的大小和構型。 大分子量的 DNA 移動的慢 小分子量的 DNA 移動的快 電泳緩沖液 陽極 陰極 DNA
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