分子生物學(xué)的基本操作(編輯修改稿)
2025-02-09 07:57 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 間的關(guān)系。 基因擴(kuò)增 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (polymerase chain reaction)，即 PCR技術(shù)，是一種在體外快速擴(kuò)增特定基因或 DNA序列的方法，故又稱為基因的體外擴(kuò)增法。 基本原理 PCR技術(shù)的基本原理類似于 DNA的天然復(fù)制過(guò)程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。 PCR由高溫變性 — 低溫退火 — 適溫延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成，經(jīng)多個(gè)循環(huán)，理論上靶 DNA分子將呈現(xiàn)指數(shù)性擴(kuò)增。 PCR Cycle Step 1 Denaturation Template DNA by Heat (95oC) Target Sequence Target Sequence PCR原理示意圖 ①模板 DNA的變性：模板 DNA經(jīng)加熱至 93℃ 左右一定時(shí)間后，使模板 DNA雙鏈或經(jīng) PCR擴(kuò)增形成的雙鏈 DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備； PCR Cycle Step 2 – Temperature is lowered (Tm ) and primers anneal to target sequences ②模板 DNA與引物的退火 (復(fù)性 )：模板 DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至 55℃ 左右，引物與模板 DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合； PCR Cycle Step 3 At 72 o C Taq DNA polymerase catalyses primer extension as plementary nucleotides are incorporated ③引物的延伸：DNA模板 引物結(jié)合物在 TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的互補(bǔ) 鏈。 End of the 1st PCR Cycle – Results in two copies of target sequence 每完成一個(gè)循環(huán)需 2～ 4分鐘， 2～ 3小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍。 Target Amplification No. of No. Amplicon Cycles Copies of Target 1 2 2 4 3 8 4 16 5 32 6 64 20 1,048,576 30 1,073,741,824 1 cycle = 2 Amplicon 2 cycle = 4 Amplicon 3 cycle = 8 Amplicon 4 cycle = 16 Amplicon 5 cycle = 32 Amplicon 6 cycle = 64 Amplicon 7 cycle = 128 Amplicon PCR儀 核酸的凝膠電泳 自從瓊脂糖 （ agarose） 和聚丙烯酰胺（ polyacrylamide） 凝膠被引入核酸研究以來(lái)，按分子量大小分離 DNA的凝膠電泳技術(shù)，已經(jīng)發(fā)展成為一種分析鑒定重組 DNA分子及蛋白質(zhì)與核酸相互作用的重要實(shí)驗(yàn)手段，也是現(xiàn)在通用的許多分子生物學(xué)研究方法，如： DNA分型、 DNA核 苷酸序列分析、限制性內(nèi)切酶片段分析以及限制酶切作圖等的技術(shù)基礎(chǔ)，受到科學(xué)界的高度重視。 基本原理 一種分子被放置到電場(chǎng)中，它就會(huì)以一定的速度移向適當(dāng)?shù)碾姌O。 電泳分子在電場(chǎng)作用下的遷移速度，叫做電泳的 遷移率 ，它與電場(chǎng)強(qiáng)度和電泳分子本身所攜帶的凈電荷數(shù)成正比，與分子同介質(zhì)的摩擦系數(shù)成反比。 已知摩擦系數(shù)是分子大小、極性及介質(zhì)粘度的函數(shù)，因此，根據(jù)分子大小的不同、構(gòu)型或形狀的差異以及所帶的凈電荷的多寡，便可以通過(guò)電泳將蛋白質(zhì)或核酸分子混合物中的各種成分彼此分離開(kāi)來(lái)。 在生理?xiàng)l件下，核酸分子之糖 磷酸骨架中的磷酸基團(tuán)，是呈離子化狀態(tài)的，所以， DNA和 RNA多核苷酸鏈又被稱為多聚陰離子（ polyanions）， 把這些核酸分子放置在電場(chǎng)當(dāng)中，它們就會(huì)向正電極的方向遷移。 在一定的電場(chǎng)強(qiáng)度下， DNA分子的這種遷移速度，亦即電泳的遷移率，取決于核酸分子本身的大小和構(gòu)型。 大分子量的 DNA 移動(dòng)的慢 小分子量的 DNA 移動(dòng)的快 電泳緩沖液 陽(yáng)極 陰極 DNA
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