【正文】 以區(qū)分的重要機理。 小鼠淋巴瘤細胞試驗（ MLA） 一般認為大、小集落突變體是由于基因損傷的范圍和程度不同所致。 小鼠淋巴瘤細胞試驗（ MLA） Cells Expression (2d) Chemical treatment (3h or 24h) Plating for PE0 Plating for PE2 Plating for TFTr Incubation (12d) Colony counting and calculation Incubation (12d) 小鼠淋巴瘤細胞試驗（ MLA） 突變集落 ?在 TK基因突變試驗中，經過 TFT選擇后長出的抗性細胞集落（即 tk/突變體）可分為兩種類型，即大集落（ λ 集落）和小集落（ σ 集落）。 ? 微孔平板（ microwell method） （即 96孔培養(yǎng)板）法在歐洲使用較多。 小鼠淋巴瘤細胞試驗（ MLA） 基本方法 ? 軟瓊脂平皿法（ soft agar method）在美國使用較多。 但 TFT的作用比 BUdR更迅速 ， TFT在一個細胞世代即可阻滯 tk+/ 細胞 ， 因此 TFT選擇平板背景清晰；而 BUdR則需要經歷數個細胞世代才能完全阻滯 tk+/ 細胞 ，故可產生分散的微小集落 （ microcolony） ， 形成特征性的背景陰影 （background haze） 。 小鼠淋巴瘤細胞試驗（ MLA） 突變選擇劑 在 MLA中最初使用 5溴脫氧尿苷 （ BUdR） 作為突變選擇劑 ， 后來改用三氟胸苷 （ TFT） 。 3 小鼠淋巴瘤細胞試驗（ MLA） 遺傳毒性傳統(tǒng)試驗方法 Thymidine Kinase (TK): 233 amino acids Coded by the autosomal tk gene tk gene: Situated at the distal end of the qarm of chromosome 11 (mouse) or chromosome 17 (human) Size of tk gene: 11 kb with 5 introns tk locus mutation: tk+ tk allele caused by T G transversion at position 489 小鼠淋巴瘤細胞試驗（ MLA） 基本原理 Target cell： Mouse lymphoma L5178Y tk +/ cell line ( . Mutat Res, 1977 ) L5178Y3 cell line （ tk +/+ ） EMS treatment cell line （ tk +/ ） cell line （ tk / ） Spontaneous reverse mutation (selected by THMG medium) MLA 基本原理 TK +/ cells (TFT sensitive THMG resistant) TK / cells (TFT resistant THMG sensitive) Mutagen treatment TK +/ cells (L5178Y, TK6, WTK1) treated by chemicals, and then selected by TFT (trifluorothymidine) The growing colony — TFT resistant ( TK / ) mutant MLA 基本原理 培養(yǎng)基 不含馬血清的 RPMI1640培養(yǎng)基 含 10%馬血清的 RPMI1640培養(yǎng)基 含 20%馬血清的 RPMI1640培養(yǎng)基 小鼠淋巴瘤細胞試驗（ MLA） 受試物處理時間 TK基因突變試驗中，要使用短時處理 (3～ 4小時 )方式。將 S9分裝成 24mL/管，冷凍保存在 70℃～ 85℃ 。 Ames試驗 代謝活化系統(tǒng) ?大鼠肝 S9混合液 ?S9制備方法：取 5只雄性大鼠，處死大鼠的前 5天單次腹腔注射給予 500 mg/kg的 Aroclor 1254。 野生型 （原養(yǎng)型） 突變型 （缺陷型） Ames試驗 ?測試系統(tǒng)：細菌 鼠傷寒沙門氏菌：組氨酸營養(yǎng)缺陷型 埃希氏大腸桿菌：色氨酸營養(yǎng)缺陷型 ?菌株特性鑒定 菌株 組 /色氨酸突變 缺失 可檢測的 突變類型 修復 LPS VIT 質粒 TA 1535 G46 urvB rfa bio 堿基置換 TA 1537 C3076 urvB rfa bio 移碼 TA97 D6610 urvB rfa bio pKM101 移碼 TA 98 D3052 urvB rfa bio pKM101 移碼 TA 100 G46 urvB rfa bio pKM101 堿基置換 TA 102 G428 urvB+ rfa bio pKM101 堿基置換 WP2uvrA tryp E uvrA pKM101 堿基置換 Ames試驗 Ames試驗 濃度設置 ?陰性對照組 /溶劑對照組； ?受試物至少五個劑量組； ?陽性對照組； Ames試驗 方法 平板摻入法： mL受試菌液； mL受試物、溶劑對照或陽性物溶液； mL磷酸鈉緩沖液 /S9混合液； mL融溶的頂層瓊脂 （ ％瓊脂、 ％ NaCl、 mM生物素 和 －組胺酸 ） 混合后，鋪于底層瓊脂上，室溫凝固。藥物遺傳毒性和致癌性研究現狀和動向 2023/1/16 1 常 艷 國家上海新藥安全評價研究中心 藥物遺傳毒性評價的指導原則 1 遺傳毒性試驗方法的研究 2 藥物致癌性評價的概要 3 傳統(tǒng)和替代致癌試驗的研究 4 4 主要內容 遺傳毒性評價的指導原則 SFDA 中國國家食品藥品監(jiān)督管理局 ICH 人用藥物注冊技術規(guī)定國際協(xié)調組織 OECD 經濟合作發(fā)展組織 EMEA 歐洲藥品評價局 US FDA 美國藥監(jiān)局 US EPA 美國環(huán)境保護署 MHLW 日本厚生勞動省 其他世界性的政府法規(guī)部門 藥物研發(fā)監(jiān)管的主要藥政實體 OECD、 EPA可供參考的遺傳毒性指導原則 遺傳毒性試驗的指導原則 SFDA 體外： 2項試驗 ? 細菌回復突變試驗（ Ames） —— Required ? 染色體畸變試驗（ CA） OR ? 小鼠淋巴瘤細胞 tk基因突變試驗（ MLA） ? 體內： 1項試驗 ? 微核試驗（ MN） —— Required 《藥物遺傳毒性研究技術指導原則》 ZH GPT 21, 2023 等同于 ICH S2B ICH