【正文】 件下的轉(zhuǎn)化：一種細(xì)菌菌株由于捕獲了來自另一種細(xì)菌菌株的DNA 而導(dǎo)致性狀特征發(fā)生遺傳性改變的生命過程。 溶液 II（溶液變粘稠，流動(dòng)性下降）： NaOH（高濃度，釋放出的物質(zhì)在強(qiáng)堿條 件下變性形成沉淀）、 SDS（去膜劑，使膜溶解，釋放細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)） 溶液 III（很多白色沉淀，流動(dòng)性較好）： KAC （中和溶液 II 的堿性，染色體 DNA 不能復(fù)性，而質(zhì)粒是小分子可以復(fù)性重新溶解，以此來分離染色體 DNA 與質(zhì)粒，剩下的沉淀是細(xì)胞碎片和不能溶解的DNA） 進(jìn)一步： CsCl（密度梯度離心）、 NaCl（密度梯度離心）、 Sepharose（凝膠過濾）。如用藍(lán)白斑篩選則經(jīng)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化的鈣化菌平板 37℃溫箱倒臵培養(yǎng) 1216hr后，有重組質(zhì)粒的細(xì)菌形成白色菌落。然而，當(dāng)外源DNA 插入到質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)后，幾乎不可避免地導(dǎo)致無α 互補(bǔ)能力的氨基端片段，使 得帶有重組質(zhì)粒的細(xì)菌形成白色菌落。這樣， lacZ基因在缺少近操縱基因區(qū)段的宿主細(xì)胞與帶有完整近操縱基因區(qū)段的質(zhì)粒之間實(shí)現(xiàn)了互補(bǔ)，稱為α 互補(bǔ)。在這個(gè)編碼區(qū)中插入了一個(gè)多克隆位點(diǎn)（ MCS），它并不破壞讀框，但可使少 數(shù)幾個(gè)氨基酸插入到β 半乳糖苷酶的氨基端而不影響功能，這種載體適用于可編碼β 半乳糖苷酶 C端部分序列的宿主細(xì)胞。 LacZ 的篩選原理是什么？ 答：是重組子篩選的一種方法： 是根據(jù)載體的遺傳特征篩選重組子，如α 互補(bǔ)、抗生素基因等。 ？ 答：在沒有選擇壓力的情況下，兩種親源關(guān)系密切的不同質(zhì)粒不能在同一個(gè)宿主細(xì)胞中穩(wěn)定存在。非 標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下，每個(gè)細(xì)菌細(xì)胞染色體平均具有的質(zhì)粒DNA 分子的數(shù)目。如果沒有，缺口可能還原維持兩種構(gòu)象的動(dòng)態(tài)平衡。 原理：當(dāng)相容性的接合質(zhì)粒和非接合質(zhì)粒在同一細(xì)胞中，非接合質(zhì)粒中mob 編碼的核酸酶作用其特異位點(diǎn) bom，使 bom 位點(diǎn)發(fā)生單鏈斷裂而出現(xiàn)缺口，構(gòu)象轉(zhuǎn)變?yōu)槿笨诃h(huán)狀構(gòu)象。 ④降解質(zhì)粒：可使宿主代謝特殊分子 ⑤侵入性質(zhì)粒：使宿主菌具有致病能力 ？什么是質(zhì)粒的遷移？遷移原理？ 答：質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移：從一個(gè) 細(xì)胞自我的轉(zhuǎn)移到原來不存在這種質(zhì)粒的另一個(gè)細(xì)胞去。 （ 3）苯酚抽提法 （ 4）反復(fù)凍融法：多次凍融使凝膠收到破壞，釋放其中 DNA，但回收率低 （ 5）電洗脫法 （ 6）硝酸纖維素膜離心法（ 7）試劑盒 ？質(zhì)粒有幾類？ 答：質(zhì)粒是一類亞細(xì)胞有機(jī)體，存在于細(xì)胞質(zhì)中獨(dú)立于染色體的遺傳成分，由環(huán)狀雙鏈 DNA 組成的復(fù)制子。 RNA 制品質(zhì)量控制？ 答： 1） RNA的濃度和純度測(cè)定 A260nm 1 OD=40 ?g/ml RNA 要求 A260nm/A280nm= ( ) A260nm/A230nm 2） RNA的完整性 變性瓊脂糖凝膠電泳檢查 28S： 18S?2： 1 3）總 RNA制品的保存 溶液法（ TE或 %SDS 方便 但不穩(wěn)定 ) 懸液法（溶液加 3V乙醇 可靠 但不方便） DNA 制備的原則是什么？各有哪些主要試劑？作用？ 答：原則：祛除蛋白及細(xì)胞碎片，祛除 RNA，保持 DNA 分子完整。 （ 3）使用對(duì) RNase有強(qiáng)烈乙酯作用的細(xì)胞裂解劑，如鹽酸胍、異硫氰胍（裂解細(xì)胞、抑制酶活性、解聚核糖體） （ 4）帶手套、口罩：阻斷 RNA酶來源，加少污染機(jī)會(huì)。 第一章 基因操作基本技術(shù) 提取細(xì)胞總 RNA 的原則是什么？如何實(shí)施？為什么 ? 答 : 原則：抑制 RNA酶活性 實(shí)施：（ 1）高溫： 180℃， 2小時(shí)，滅活 RNase （ 2）二乙基焦炭酸乙酯（ DEPC） ,油狀有毒 , 是一種強(qiáng)烈但不徹底的RNA 酶抑制劑。 （ 4）促進(jìn)對(duì)生命現(xiàn)象本質(zhì)機(jī)理的研究：胰島素基因與糖尿病、癌基因與抗癌基因。 （ 2） 對(duì)檢測(cè)技術(shù)的貢獻(xiàn)：提供大量高純靶，提高準(zhǔn)確性；病原體檢出（ HCV HBV HIV）；遺傳病診斷。主要內(nèi)容 : 第一章 基因操作的基本技術(shù) 核酸制備；質(zhì)粒及質(zhì)粒載體；細(xì)菌的轉(zhuǎn)化；凝膠電泳；核酸探針；限制性內(nèi)切酶、酶切圖譜及分子克隆用酶 第二章 PCR 技術(shù) 第三章 核酸分析與合成 第四章 噬菌體載體及粘粒 第五章 目的基因的準(zhǔn)備和重組及重組子的鑒定 第六章 基因在原核及真核體系中的表達(dá) 真核基因在大腸桿菌中的表達(dá)；哺乳動(dòng)物基因工程；研究 DNA與蛋白質(zhì)相互作用的方法 第七章 植物基因工程 第八章 基因工程研究進(jìn)展 人類基因組計(jì)劃；基因診斷、基因治療和轉(zhuǎn)基因；反義技術(shù) 序言： ？基因工程是如何誕生的 ？ 答：在體外將核酸分子插入病毒、質(zhì)粒或其他載體分子中，構(gòu)成遺傳物質(zhì)的新組合，并使之摻入到原先沒有這類分子的宿主細(xì)胞中，并能持續(xù)穩(wěn)定的繁殖。 ？ 答：（ 1）跨越天然的物種屏障（ 2）確定的 DNA 擴(kuò)增 ？ 答：酶切分離目的基因→重組 DNA 分子→轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞增殖→獲得篩選目的重組子 (→提取目的基因供進(jìn)一步研究→重組目的基因功能表達(dá) ) ? 答： (1)帶來體外蛋白質(zhì)化學(xué)的革命 :甲型干擾素， 紅細(xì)胞生成素。 （ 3）直接的遺傳性疾病治療和生物體改造：轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物。 “安全”的宿主 — 載體體系？ 答：失去自我遷移能力，可以是營(yíng)養(yǎng)缺陷性，在自然環(huán)境下無法生存。它使蛋白質(zhì)變性，從而抑制酶的活性。 （ 5）季節(jié)因素（溫度）： RNase降解 RNA溫度高活性高，需要低溫進(jìn)行。 主要試劑及作用： SDS（破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)、變性蛋白質(zhì)、解聚） EDTA（抑制酶活性） Proteinase K（蛋白酶消化蛋白質(zhì)） DNA 樣品的鑒定？ 答： A260nm 1 OD=50 ?g/ml DNA 要求 A260nm/A280nm A260nm/A230nm 5. 有哪些方法可以進(jìn)行 DNA 片段的制備？是如何進(jìn)行的？ 答：（ 1）低熔點(diǎn)瓊脂糖（羥乙基 60?C65 ?C熔化，結(jié)果較純） （ 2）透析袋法：需要把樣品濃縮，把核酸沉淀，而去掉緩沖液。 分為： ① F質(zhì)粒（致育質(zhì)粒，可以通過接合，在供體和受體間傳遞遺傳物質(zhì)） ② R質(zhì)粒（抗性質(zhì)粒，帶有抗性基因，可使宿主菌對(duì)某些抗菌素產(chǎn)生抗性） ③ Col 質(zhì)粒：帶有編碼大腸桿菌素的基因。 質(zhì)粒的遷移：由共存的接合型質(zhì)粒引發(fā)非接合型質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移過程。當(dāng)有接合性質(zhì)粒中 F因子能夠?qū)е滦皂毜暮铣?，提供轉(zhuǎn)移裝臵，則可以轉(zhuǎn)移。 ？質(zhì)粒的復(fù)制類型？ 答：定義：生長(zhǎng)在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下，每個(gè)細(xì)菌細(xì)胞中所含有的質(zhì)粒 DNA分子的數(shù)目。 類型：一類是嚴(yán)緊型質(zhì)粒，當(dāng)細(xì)胞染色體復(fù)制一次時(shí)，質(zhì)粒也復(fù)制一次，每個(gè)細(xì)胞內(nèi)只有 1～ 2個(gè)質(zhì)粒；另一類是松弛型質(zhì)粒，當(dāng)染色體復(fù)制停止后仍然能繼續(xù)復(fù)制，每一個(gè)細(xì)胞內(nèi)一般有 20個(gè)左右質(zhì)粒。 ？為什么？ 答： (i) 具若干限制酶單一識(shí)別位點(diǎn)：可提供多種選擇，具有多個(gè)同一種酶切位點(diǎn)則可能被切碎 (ii) 具有復(fù)制起點(diǎn)：可導(dǎo)入宿主細(xì)胞，也是質(zhì)粒自我增值必不可少條件（ iii）具有選擇標(biāo)記：便于篩選（ iv）具有較小的分子量和較高的拷貝數(shù)：操作簡(jiǎn)單，可攜帶較大片段的基因，并有利于載體的穩(wěn)定?，F(xiàn)在使用的許多載體都帶有一個(gè)大腸桿菌的DNA 的短區(qū)段，其中有β 半乳糖苷酶基因（ lacZ）的調(diào)控序列和前 146個(gè)氨基酸的編碼信息。因此，宿主和質(zhì)粒編碼的片段雖都沒有酶活性，但它們同時(shí)存在時(shí)，可形成具有酶學(xué)活性的蛋白質(zhì)。由α 互補(bǔ)而產(chǎn)生的 LacZ+細(xì)菌在誘導(dǎo)劑 IPTG 的作用下，在生色底物 XGal存在時(shí)產(chǎn)生藍(lán)色菌落，因而易于識(shí)別。這種重組子的