[基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)]核酸疫苗及免疫研究進(jìn)展-展示頁
2025-03-03 00:53本頁面
【正文】 等多種 基因疫苗的構(gòu)建 二、基因疫苗的構(gòu)建方法 獲得需要的目的基因常用的方法： （ 1）直接從生物體中提取總 DNA，構(gòu)建基因組 DNA文庫 (genomic DNA library)，從中調(diào)用目的基因； （ 2）以 mRNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成互補的DNA片段，建立 cDNA文庫； （ 3）利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（ PCR）特異性地擴(kuò)增所需要的目的基因片段，等等。 基因疫苗的構(gòu)建 基因疫苗構(gòu)建的基本途徑 基因疫苗的構(gòu)建 一、構(gòu)建基因疫苗的載體 載體是將抗原基因?qū)氲綑C體細(xì)胞的必要工具。主題：核酸疫苗預(yù)防傳染性疾病和控制核酸疫苗。主題： DNA疫苗：疫苗學(xué)的新時代。主題：基因疫苗和核酸疫苗戰(zhàn)略。主題：核酸疫苗。 關(guān)于核酸免疫的國際會議 ? 1994年 5月 1718日，瑞士日內(nèi)瓦。 ? 1993年 Ulmer等將注射技術(shù)用于研究流感核酸疫苗，證實核酸注射不但能在體內(nèi)表達(dá)抗原蛋白，還可以誘導(dǎo)具有顯著保護(hù)作用的免疫應(yīng)答。 ? 1991年 Williams等發(fā)現(xiàn)外源基因輸入體內(nèi)的表達(dá)產(chǎn)物可誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫應(yīng)答。 基因疫苗被稱為 第三代疫苗 。目前前兩代均不能滿足上述標(biāo)準(zhǔn)。 將用基因工程的方法研制的亞單位疫苗稱為 第二代疫苗 。核酸疫苗 LOGO Diagram 4 核酸疫苗定義 1 2 3 5 核酸疫苗的發(fā)展史 核酸疫苗的作用原理 核酸疫苗的構(gòu)建 核酸疫苗的優(yōu)缺點和應(yīng)用現(xiàn)狀 疫苗 是將病原微生物（如細(xì)菌、立克次氏體、病毒等）及其代謝產(chǎn)物，經(jīng)過人工減毒、滅活或利用基因工程等方法制成的用于預(yù)防傳染病的自動免疫制劑。 人們將多種滅活或減毒疫苗稱為 第一代疫苗 。 理想疫苗應(yīng)具備的特征有：安全、廉價、熱穩(wěn)定性好，含有多種具有保護(hù)作用的免疫原，最好是一次口服即可生效。故基因疫苗應(yīng)運而生。 ? 1990年 wolff等從事于基因治療工作時，用外源性重組質(zhì)粒給小鼠肌肉注射后，質(zhì)粒被攝取并能在體內(nèi)至少兩個月穩(wěn)定地表達(dá)所編碼蛋白。 ? 1992年 Tang等將表達(dá)人生長激素的基因質(zhì)粒 DNA導(dǎo)入小鼠皮內(nèi)，小鼠產(chǎn)生特異性抗體，從而提出了基因免疫的概念。 ? 因此， 1994年在日內(nèi)瓦召開的專題會議上將這種疫苗定名為核酸疫苗。WHO主辦。 ? 1995年 2月 1617日，美國馬里蘭州，Bethesda（ NIH）。 ? 1995年 4月 69日，美國弗吉尼亞州。 ? 1996年 2月 58日，美國馬里蘭州 NIH Natcher會議中心。 定義 核酸疫苗 (nucleic acid vaccine),也稱基因疫苗 (geic vaccine),是指一類將抗原基因重組到表達(dá)載體上的重組質(zhì)粒疫苗，經(jīng) 肌肉注射 或黏膜免疫等方法導(dǎo)入宿主體內(nèi)，通過宿主細(xì)胞表達(dá)抗原蛋白，誘導(dǎo)宿主細(xì)胞產(chǎn)生對該抗原蛋白的免疫應(yīng)答，以達(dá)到預(yù)防和治療疾病的目的。 按照載體功能可分為克隆載體和表達(dá)載體； 按照載體來源可分為質(zhì)粒、噬菌體、黏粒和病毒載體等。 （ 4）化學(xué)合成 基因疫苗的構(gòu)建 基因表達(dá)載體的組成： 復(fù)制原點 +啟動子 +目的基因 +終止子 +標(biāo)記基因 為了保證抗原基因的定向正確插入，只有以正確的方向插入表達(dá)載體讀框啟動子下游才能表達(dá)抗原基因，故抗原基因兩端應(yīng)具有不同的酶切位點，在設(shè)計時須注意這點。連接反應(yīng)時應(yīng)考慮反應(yīng)體積、抗原基因與載體的比例、溫度和時間和酶量。 轉(zhuǎn)染：將質(zhì)?；蛘咭运鼮檩d體構(gòu)建的重組子導(dǎo)入 真核細(xì)胞 的過程。其原理是細(xì)菌處于 0℃ 、低滲CaCl2溶液中時，細(xì)胞壁和細(xì)胞膜通透性增加。 常用的方法為氯化鈣共沉淀法和電穿孔法。 （ 2）插入片段方向性鑒定：可利用聯(lián)合酶切方案進(jìn)行目的基因的插入方向鑒定。 （ 1）蛋白水平的檢測：免疫沉淀法檢測表達(dá)蛋白； Western印跡檢測；酶聯(lián)免疫吸附測定。 由于這個過程實際上是相當(dāng)復(fù)雜的，所以人們對一些具體的細(xì)節(jié)并不清楚。 基因疫苗經(jīng)黏膜和皮膚組織免疫的抗原呈遞 皮膚或者黏膜是具有高水平免疫監(jiān)視系統(tǒng)的組織， 黏膜淋巴組織的功能：參與粘膜局部免疫應(yīng)答和產(chǎn)生分泌型 IgA。 基因疫苗經(jīng)過黏膜和皮膚組織免疫可以分為直接免疫機體和重組減毒胞內(nèi)菌系統(tǒng)免疫兩種形式。黏膜淋巴結(jié)提供了漿細(xì)胞抗體型轉(zhuǎn)化與 Th0細(xì)胞向 Th2細(xì)胞定向分化的微環(huán)境。 （ 2）用重組減毒胞內(nèi)菌系統(tǒng) 采用志賀氏菌、沙門氏菌或李斯特菌等重組減毒胞內(nèi)菌系統(tǒng)，通過粘膜自然感染途徑運送 DNA 疫苗是一類很好的方法。 減毒沙門氏菌通過自然感染的方式高效地將基因疫苗直接運送給體內(nèi)的抗原提呈細(xì)胞（ APCs）如樹突細(xì)胞（ DCs）和巨噬細(xì)胞，在粘膜和全身淋巴組織誘發(fā)以 Th1 型應(yīng)答為主的細(xì)胞免疫和體液免疫， APCs尤其是 DCs可能在其中起到了關(guān)鍵作用。 可能途徑一 ： DCs 和巨噬細(xì)胞吞噬侵入腸粘膜屏障的重組沙門氏菌并被激活，活化的 DCs 和巨噬細(xì)胞遷移到脾臟等淋巴組織（ DCs 具有很強的遷移能力，而巨噬細(xì)胞尚有一些疑問），載體菌在此裂解，基因疫苗進(jìn)入胞液，然后進(jìn)入細(xì)胞核，最后表達(dá)目的抗原。 可能途徑二 ：重組沙門氏菌引起吞噬它的 APCs 凋亡，凋亡產(chǎn)物（含有目的抗原 / 基因疫苗）被鄰近的 APCs 吞噬。人們期望用核酸疫苗來征服諸如微生物感染性疾病、寄生蟲病等頑癥，并用于腫瘤、遺傳病和其他多種疾病的基因水平治療，所以作了多方面的嘗試。現(xiàn)在已獲得了迅速的發(fā)展。核酸疫苗可能對人類疾病的防治以及畜牧業(yè)的健康發(fā)展起到劃時代的作用。 （一）概 念 （二） DNA疫苗的構(gòu)成： 1. 抗原表達(dá)基因 2. 真核細(xì)胞啟動子（如 CMV ） 3
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