【正文】 ious methods of gene delivery 三、 DNA疫苗與常規(guī)疫苗的比較 DNA疫苗 減毒活疫苗 滅活疫苗 /蛋白亞單位 抗原類型 內(nèi)源性 內(nèi)源性 外源性 APC加工過程 蛋白酶體 蛋白酶體 溶酶體 體液免疫應(yīng)答 B細(xì)胞 ＋＋＋ ＋＋＋ ＋＋＋ 主要的 IgG類別 IgG2a IgG2a IgG1 DNA疫苗與常規(guī)疫苗比較 DNA疫苗 減毒活疫苗 滅活疫苗 /蛋白亞單位 細(xì)胞免疫應(yīng)答 CD4＋ ＋＋＋ Th ＋ /－ Th1 ＋ /－ Th1 CD8＋ ＋＋ ＋＋＋ － 抗原提呈 Ⅰ/Ⅱ Ⅰ/Ⅱ Ⅱ 免疫記憶 體液免疫 ＋＋＋ ＋＋＋ ＋＋＋ 細(xì)胞免疫 ＋＋ ＋＋＋ ＋ /－ 參與細(xì)胞因子 IL2, 4， IFNγ, TNFβ IL2,IFNγ,TNF β IL4， 5，10,13 DNA疫苗與常規(guī)疫苗比較 (續(xù) 1） DNA疫苗 減毒活疫苗 滅活疫苗 /蛋白亞單位 效應(yīng)機(jī)制 CTL CTL 中和反應(yīng) 激活補(bǔ)體 ADCC效應(yīng) 制備 易于構(gòu)建、生產(chǎn) ＋＋＋＋ ＋ ＋＋ 費(fèi)用 ＋＋＋ ＋ ＋ 運(yùn)輸 /存儲(chǔ) ＋＋＋ ＋ ＋＋＋ 安全性 ＋＋＋ ＋＋ ＋＋＋＋ DNA疫苗與常規(guī)疫苗比較 (續(xù) 2） 核酸疫苗與第一、二代疫苗相比具有如下優(yōu)勢(shì) ： (1)誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生全面的免疫應(yīng)答 ， 其保護(hù)性免疫應(yīng)答對(duì)不同亞型的病原體具有交叉抵御作用； (2)無減毒 、 滅活疫苗可能引起的致病作用 ， 具有可靠的安全性； (3)能表達(dá)經(jīng)修飾的天然抗原 ， 具有與天然抗原相同的構(gòu)象和抗原性； (4)與亞單位疫苗共有的高產(chǎn)性； (5)可將編碼不同抗原的基因構(gòu)建在同一個(gè)質(zhì)粒中 ， 或?qū)⒉煌乖虻亩喾N重組質(zhì)粒聯(lián)合應(yīng)用 ， 制備多價(jià)核酸疫苗； (6)核酸疫苗既有預(yù)防作用 ， 也有治療作用； (7)生產(chǎn)簡(jiǎn)便 ， 成本低廉 ， 穩(wěn)定性好 ， 貯運(yùn)方便 。黏膜淋巴結(jié)提供了漿細(xì)胞抗體型轉(zhuǎn)化與 Th0細(xì)胞向 Th2細(xì)胞定向分化的微環(huán)境。 轉(zhuǎn)染：將質(zhì)粒或者以它為載體構(gòu)建的重組子導(dǎo)入 真核細(xì)胞 的過程。WHO主辦。 將用基因工程的方法研制的亞單位疫苗稱為 第二代疫苗 。主題： DNA疫苗：疫苗學(xué)的新時(shí)代。 基因疫苗的構(gòu)建 一般重組質(zhì)粒鑒定主要按照表型篩選、酶切鑒定和測(cè)序鑒定的順序進(jìn)行 （ 1）插入片段鑒定：酶切鑒定； PCR鑒定。 攜帶基因疫苗重組減毒沙門氏菌誘發(fā)機(jī)體免疫應(yīng)答的機(jī)制 重組減毒沙門氏菌攜帶的基因疫苗激發(fā)機(jī)體的細(xì)胞免疫和體液免疫的機(jī)制還不完全清楚 。 間接免疫熒光法 重組質(zhì)粒 pTARGEThanS體外瞬間表達(dá) : 核蛋白的瞬時(shí)表達(dá)結(jié)果 作為 DNA免疫的注射樣品 。 ? 用各種構(gòu)建的質(zhì)粒載體進(jìn)行的質(zhì)粒 DNA的免疫并未發(fā)現(xiàn)抗 DNA抗體的產(chǎn)生。 持續(xù)高表達(dá) 超免反應(yīng)發(fā)生 — 免疫抑制 — 其它病原感染。 核酸疫苗研究 進(jìn)展 一、概 述 核酸疫苗又稱基因疫苗或 DNA疫苗，就是把外源基因克隆到真核質(zhì)粒表達(dá)載體上，然后將重組的質(zhì)?；蛑苯用庖邫C(jī)體 ，使外源基因在活體內(nèi)表達(dá)，產(chǎn)生的抗原激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)，引發(fā)免疫反應(yīng)。 （ 1）直接免疫 旅美中國(guó)科學(xué)家范泓然用皮膚涂抹法給小鼠接種乙肝疫苗取得成功，且檢測(cè)其效果可以和所用的肌肉注射相媲美。 粘性末端連接 用同一種或兩種 限制性內(nèi)切酶 酶切 DNA連接酶 重組質(zhì)粒 質(zhì)粒 目的基因 本法適用于在質(zhì)粒和目的基 因上有 相同 單或雙酶切位點(diǎn) 平末端連接 質(zhì)粒 產(chǎn)生 平末端 的 內(nèi)切酶 DNA連接酶 核酸酶 S1 目的基因 重組質(zhì)粒 本法適用于在質(zhì)粒 和目的基因上 沒有 相同 的酶切位點(diǎn)！ 基因疫苗的構(gòu)建 轉(zhuǎn)化：將質(zhì)?；蛘咭运鼮檩d體構(gòu)建的重組子導(dǎo)入 細(xì)菌 的過程。 關(guān)于核酸免疫的國(guó)際會(huì)議 ? 1994年 5月 1718日，瑞士日內(nèi)瓦。 理想疫苗應(yīng)具備的特征有：安全、廉價(jià)、熱穩(wěn)定性好，含有多種具有保護(hù)作用的免疫原，最好是一次口服即可生效。 ? 1996年 2月 58日，美國(guó)馬里蘭州 NIH Natcher會(huì)議中心。 （ 2）插入片段方向性鑒定：可利用聯(lián)合酶切方案進(jìn)行目的基因的插入方向鑒定。 可能途徑一 ： DCs 和巨噬細(xì)胞吞噬侵入腸粘膜屏障的重組沙門氏菌并被激活，活化的 DCs 和巨噬細(xì)胞遷移到脾臟等淋巴組織（ DCs 具有很強(qiáng)的遷移能力，而巨噬細(xì)胞尚有一些疑問），載體菌在此裂解，基因疫苗進(jìn)入胞液，然后進(jìn)入細(xì)胞核，最后表達(dá)目的抗原。 質(zhì)粒的大量制備及純化 : 按分子克隆手冊(cè)所述方法提純質(zhì)粒 +和 +S 用滅菌的 PBS溶解 調(diào)整濃度至 用分光光度計(jì)測(cè)定 A260/A280比值以確定核酸樣品的純度， A260確定樣品的濃度 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的 DNA免疫 6～ 8W 齡的 BABC/c小鼠 空白質(zhì)粒 + 重組質(zhì)粒 +S 免疫前先用鹽酸布比卡因注射液預(yù)處理 3天后 相同部位進(jìn)行 DNA接種 加強(qiáng)免疫一次 ， 共免疫 3次 。 ? DNA疫苗接種有自身免疫傾向的小鼠，重復(fù)給藥并沒有啟動(dòng)或加重具有狼瘡傾向個(gè)體的疾病發(fā)生及發(fā)展過程。 持續(xù)低表達(dá) 可被抗體中和清除 ， 無足夠的免疫應(yīng)答 。核酸疫苗可能對(duì)人類疾病的防治以及畜牧業(yè)的健康發(fā)展起到劃時(shí)代的作用。 基因疫苗經(jīng)過黏膜和皮膚組織免