[基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)]核酸疫苗及免疫研究進(jìn)展-在線瀏覽
2025-04-11 00:53本頁面
【正文】 . Poly A 終止序列（如來自 SV40 或 BGH基因） 4. 原核細(xì)胞選擇標(biāo)志（如青霉素抗性基因） 5. 增強(qiáng)免疫原性的核苷酸序列（如非甲基化 CpG二核苷 ) 二、 DNA疫苗載體 1. 裸 DNA疫苗：質(zhì)粒、 MIDGE載體 2. 病毒載體： 天花病毒、腺病毒 3. 細(xì)菌載體：減毒活菌苗和繁殖缺陷細(xì)菌，如傷寒菌苗、腸炎沙門氏菌苗、志賀氏菌苗、單核細(xì)胞增生李斯特菌苗和小腸炎耶爾森氏菌苗 4. 微粒包裹載體：金顆粒 (gold particle)、脂質(zhì)體 (liposomes)、聚丙交酯 聚乙交酯（ PLGA）、藻酸鹽微粒 (alginate)、和納米微粒 (nanoparticles) Various methods of gene delivery 三、 DNA疫苗與常規(guī)疫苗的比較 DNA疫苗 減毒活疫苗 滅活疫苗 /蛋白亞單位 抗原類型 內(nèi)源性 內(nèi)源性 外源性 APC加工過程 蛋白酶體 蛋白酶體 溶酶體 體液免疫應(yīng)答 B細(xì)胞 ＋＋＋ ＋＋＋ ＋＋＋ 主要的 IgG類別 IgG2a IgG2a IgG1 DNA疫苗與常規(guī)疫苗比較 DNA疫苗 減毒活疫苗 滅活疫苗 /蛋白亞單位 細(xì)胞免疫應(yīng)答 CD4＋ ＋＋＋ Th ＋ /－ Th1 ＋ /－ Th1 CD8＋ ＋＋ ＋＋＋ － 抗原提呈 Ⅰ/Ⅱ Ⅰ/Ⅱ Ⅱ 免疫記憶 體液免疫 ＋＋＋ ＋＋＋ ＋＋＋ 細(xì)胞免疫 ＋＋ ＋＋＋ ＋ /－ 參與細(xì)胞因子 IL2, 4， IFNγ, TNFβ IL2,IFNγ,TNF β IL4， 5，10,13 DNA疫苗與常規(guī)疫苗比較 (續(xù) 1） DNA疫苗 減毒活疫苗 滅活疫苗 /蛋白亞單位 效應(yīng)機(jī)制 CTL CTL 中和反應(yīng) 激活補(bǔ)體 ADCC效應(yīng) 制備 易于構(gòu)建、生產(chǎn) ＋＋＋＋ ＋ ＋＋ 費(fèi)用 ＋＋＋ ＋ ＋ 運(yùn)輸 /存儲(chǔ) ＋＋＋ ＋ ＋＋＋ 安全性 ＋＋＋ ＋＋ ＋＋＋＋ DNA疫苗與常規(guī)疫苗比較 (續(xù) 2） 核酸疫苗與第一、二代疫苗相比具有如下優(yōu)勢 ： (1)誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生全面的免疫應(yīng)答 ， 其保護(hù)性免疫應(yīng)答對不同亞型的病原體具有交叉抵御作用； (2)無減毒 、 滅活疫苗可能引起的致病作用 ， 具有可靠的安全性； (3)能表達(dá)經(jīng)修飾的天然抗原 ， 具有與天然抗原相同的構(gòu)象和抗原性； (4)與亞單位疫苗共有的高產(chǎn)性； (5)可將編碼不同抗原的基因構(gòu)建在同一個(gè)質(zhì)粒中 ， 或?qū)⒉煌乖虻亩喾N重組質(zhì)粒聯(lián)合應(yīng)用 ， 制備多價(jià)核酸疫苗； (6)核酸疫苗既有預(yù)防作用 ， 也有治療作用； (7)生產(chǎn)簡便 ， 成本低廉 ， 穩(wěn)定性好 ， 貯運(yùn)方便 。 Immune mechanisms induced by inoculation with naked DNA Depiction of the mechanisms of generation of antigenspecific humoural and cellular responses. 五 、 核酸疫苗的構(gòu)建 將亞單位疫苗的編碼基因作為核酸疫苗的候選基因 。 培養(yǎng) VeroE6細(xì)胞 MEM培養(yǎng)基 (10%FCS) 37℃ ， 5%CO2 細(xì)胞長至對數(shù)生長期 電穿孔轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒 轉(zhuǎn)染后 72h， 收獲細(xì)胞 檢測核蛋白的瞬時(shí)表達(dá) ,熒光顯微鏡下觀察并拍照 。 質(zhì)粒的大量制備及純化 : 按分子克隆手冊所述方法提純質(zhì)粒 +和 +S 用滅菌的 PBS溶解 調(diào)整濃度至 用分光光度計(jì)測定 A260/A280比值以確定核酸樣品的純度， A260確定樣品的濃度 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的 DNA免疫 6～ 8W 齡的 BABC/c小鼠 空白質(zhì)粒 + 重組質(zhì)粒 +S 免疫前先用鹽酸布比卡因注射液預(yù)處理 3天后 相同部位進(jìn)行 DNA接種 加強(qiáng)免疫一次 ， 共免疫 3次 。 重組的 NP作為包被物 ， 辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠 IgG為二抗 ELISA法檢測血清的抗 NP抗體 血清抗 NP抗體滴度的測定 : 將初次免疫后 42天的免疫鼠眼球取血 N=6/group 留置血清 ， 以 10倍稀釋為起點(diǎn) ,再做系列稀釋 ELISA法 檢測血清抗體滴度 六 、 核酸疫苗的優(yōu)化 免疫效果的優(yōu)化 選擇高效表達(dá)載體 添加 DNA免疫激活序列 免疫途徑的優(yōu)化 肌肉注射（ im） 基因槍導(dǎo)入 皮內(nèi) (id)和皮下 (sc)注射 黏膜表面接種 Effects of CpG motifs on various cells Generation of Immunity after Inoculation of DNA Plasmid with GpG Motifs 免疫途徑的優(yōu)化 基因佐劑 的應(yīng)用 細(xì)胞因子類 共刺激分子 分子佐劑聯(lián)合 抗原蛋白的泛素化表達(dá) IL1 IL1 IL18及 IFNγ以增強(qiáng) Th1型細(xì)胞應(yīng)答為主 。 有關(guān)基因整合的研究 一個(gè)最重要的理論危機(jī)是質(zhì)粒 DNA與宿主基因組整合的問題，因?yàn)楫?dāng)外源 DNA與基因組整合后，可能因插入活性癌基因、或活化宿主原癌基因、或使抑癌基因失活，或引起染色體斷裂，或染色體重排而致染色體不穩(wěn)定，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞形成。 其整合發(fā)生率較自然整合發(fā)生率低 3個(gè)數(shù)量級 ， 另鮭魚精 DNA已經(jīng)以一種非處方藥形式經(jīng)口服或注射等多種方式使用了數(shù)十年 ， 卻未見任何明顯的副作用 。 持續(xù)低表達(dá) 可被抗體中和清除 ， 無足夠的免疫應(yīng)答 。
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