[基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)]核酸疫苗及免疫研究進(jìn)展-wenkub
2023-03-09 00:53:02 本頁(yè)面
【正文】 物酶標(biāo)記的羊抗鼠 IgG為二抗 ELISA法檢測(cè)血清的抗 NP抗體 血清抗 NP抗體滴度的測(cè)定 : 將初次免疫后 42天的免疫鼠眼球取血 N=6/group 留置血清 ， 以 10倍稀釋為起點(diǎn) ,再做系列稀釋 ELISA法 檢測(cè)血清抗體滴度 六 、 核酸疫苗的優(yōu)化 免疫效果的優(yōu)化 選擇高效表達(dá)載體 添加 DNA免疫激活序列 免疫途徑的優(yōu)化 肌肉注射（ im） 基因槍導(dǎo)入 皮內(nèi) (id)和皮下 (sc)注射 黏膜表面接種 Effects of CpG motifs on various cells Generation of Immunity after Inoculation of DNA Plasmid with GpG Motifs 免疫途徑的優(yōu)化 基因佐劑 的應(yīng)用 細(xì)胞因子類 共刺激分子 分子佐劑聯(lián)合 抗原蛋白的泛素化表達(dá) IL1 IL1 IL18及 IFNγ以增強(qiáng) Th1型細(xì)胞應(yīng)答為主 。 培養(yǎng) VeroE6細(xì)胞 MEM培養(yǎng)基 (10%FCS) 37℃ ， 5%CO2 細(xì)胞長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期 電穿孔轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒 轉(zhuǎn)染后 72h， 收獲細(xì)胞 檢測(cè)核蛋白的瞬時(shí)表達(dá) ,熒光顯微鏡下觀察并拍照 。 （一）概 念 （二） DNA疫苗的構(gòu)成： 1. 抗原表達(dá)基因 2. 真核細(xì)胞啟動(dòng)子（如 CMV ） 3. Poly A 終止序列（如來(lái)自 SV40 或 BGH基因） 4. 原核細(xì)胞選擇標(biāo)志（如青霉素抗性基因） 5. 增強(qiáng)免疫原性的核苷酸序列（如非甲基化 CpG二核苷 ) 二、 DNA疫苗載體 1. 裸 DNA疫苗：質(zhì)粒、 MIDGE載體 2. 病毒載體： 天花病毒、腺病毒 3. 細(xì)菌載體：減毒活菌苗和繁殖缺陷細(xì)菌，如傷寒菌苗、腸炎沙門氏菌苗、志賀氏菌苗、單核細(xì)胞增生李斯特菌苗和小腸炎耶爾森氏菌苗 4. 微粒包裹載體：金顆粒 (gold particle)、脂質(zhì)體 (liposomes)、聚丙交酯 聚乙交酯（ PLGA）、藻酸鹽微粒 (alginate)、和納米微粒 (nanoparticles) Various methods of gene delivery 三、 DNA疫苗與常規(guī)疫苗的比較 DNA疫苗 減毒活疫苗 滅活疫苗 /蛋白亞單位 抗原類型 內(nèi)源性 內(nèi)源性 外源性 APC加工過(guò)程 蛋白酶體 蛋白酶體 溶酶體 體液免疫應(yīng)答 B細(xì)胞 ＋＋＋ ＋＋＋ ＋＋＋ 主要的 IgG類別 IgG2a IgG2a IgG1 DNA疫苗與常規(guī)疫苗比較 DNA疫苗 減毒活疫苗 滅活疫苗 /蛋白亞單位 細(xì)胞免疫應(yīng)答 CD4＋ ＋＋＋ Th ＋ /－ Th1 ＋ /－ Th1 CD8＋ ＋＋ ＋＋＋ － 抗原提呈 Ⅰ/Ⅱ Ⅰ/Ⅱ Ⅱ 免疫記憶 體液免疫 ＋＋＋ ＋＋＋ ＋＋＋ 細(xì)胞免疫 ＋＋ ＋＋＋ ＋ /－ 參與細(xì)胞因子 IL2, 4， IFNγ, TNFβ IL2,IFNγ,TNF β IL4， 5，10,13 DNA疫苗與常規(guī)疫苗比較 (續(xù) 1） DNA疫苗 減毒活疫苗 滅活疫苗 /蛋白亞單位 效應(yīng)機(jī)制 CTL CTL 中和反應(yīng) 激活補(bǔ)體 ADCC效應(yīng) 制備 易于構(gòu)建、生產(chǎn) ＋＋＋＋ ＋ ＋＋ 費(fèi)用 ＋＋＋ ＋ ＋ 運(yùn)輸 /存儲(chǔ) ＋＋＋ ＋ ＋＋＋ 安全性 ＋＋＋ ＋＋ ＋＋＋＋ DNA疫苗與常規(guī)疫苗比較 (續(xù) 2） 核酸疫苗與第一、二代疫苗相比具有如下優(yōu)勢(shì) ： (1)誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生全面的免疫應(yīng)答 ， 其保護(hù)性免疫應(yīng)答對(duì)不同亞型的病原體具有交叉抵御作用； (2)無(wú)減毒 、 滅活疫苗可能引起的致病作用 ， 具有可靠的安全性； (3)能表達(dá)經(jīng)修飾的天然抗原 ， 具有與天然抗原相同的構(gòu)象和抗原性； (4)與亞單位疫苗共有的高產(chǎn)性； (5)可將編碼不同抗原的基因構(gòu)建在同一個(gè)質(zhì)粒中 ， 或?qū)⒉煌乖虻亩喾N重組質(zhì)粒聯(lián)合應(yīng)用 ， 制備多價(jià)核酸疫苗； (6)核酸疫苗既有預(yù)防作用 ， 也有治療作用； (7)生產(chǎn)簡(jiǎn)便 ， 成本低廉 ， 穩(wěn)定性好 ， 貯運(yùn)方便 。現(xiàn)在已獲得了迅速的發(fā)展。 可能途徑二 ：重組沙門氏菌引起吞噬它的 APCs 凋亡，凋亡產(chǎn)物（含有目的抗原 / 基因疫苗）被鄰近的 APCs 吞噬。 減毒沙門氏菌通過(guò)自然感染的方式高效地將基因疫苗直接運(yùn)送給體內(nèi)的抗原提呈細(xì)胞（ APCs）如樹突細(xì)胞（ DCs）和巨噬細(xì)胞，在粘膜和全身淋巴組織誘發(fā)以 Th1 型應(yīng)答為主的細(xì)胞免疫和體液免疫， APCs尤其是 DCs可能在其中起到了關(guān)鍵作用。黏膜淋巴結(jié)提供了漿細(xì)胞抗體型轉(zhuǎn)化與 Th0細(xì)胞向 Th2細(xì)胞定向分化的微環(huán)境。 基因疫苗經(jīng)黏膜和皮膚組織免疫的抗原呈遞 皮膚或者黏膜是具有高水平免疫監(jiān)視系統(tǒng)的組織， 黏膜淋巴組織的功能：參與粘膜局部免疫應(yīng)答和產(chǎn)生分泌型 IgA。 （ 1）蛋白水平的檢測(cè)：免疫沉淀法檢測(cè)表達(dá)蛋白； Western印跡檢測(cè)；酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定。 常用的方法為氯化鈣共沉淀法和電穿孔法。 轉(zhuǎn)染：將質(zhì)?；蛘咭运鼮檩d體構(gòu)建的重組子導(dǎo)入 真核細(xì)胞 的過(guò)程。 （ 4）化學(xué)合成 基因疫苗的構(gòu)建 基因表達(dá)載體的組成： 復(fù)制原點(diǎn) +啟動(dòng)子 +目的基因 +終止子 +標(biāo)記基因 為了保證抗原基因的定向正確插入，只有以正確的方向插入表達(dá)載體讀框啟動(dòng)子下游才能表達(dá)抗原基因，故抗原基因兩端應(yīng)具有不同的酶切位點(diǎn)，在設(shè)計(jì)時(shí)須注意這點(diǎn)。
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