【正文】 e ↓轉(zhuǎn)錄 mRNA ↓翻譯 110kD (pRb核蛋白 ) ↓調(diào)控 細(xì)胞增殖 RB廣泛表達(dá)，編碼 110Kda核蛋白 pRB。在腫瘤細(xì)胞中 LOH 提示TSG 的存在，在染色體某一區(qū)域 LOH頻率高，可能為 TSG 的侯選位點(diǎn)。 13 ④ 雜合性丟失 ? 雜合性丟失（ Loss of heterozygosity, LOH ） ? 應(yīng)用于檢測(cè)、鑒定 TSG 。 11 B、 Wilms 瘤 ? 在 Wilms瘤患者中發(fā)現(xiàn) 11p13， WT1 Gene定位于 11p13 區(qū)域， 認(rèn)為 WT1為 TSG。 ? ? 證明抑制基因存在于單個(gè)染色體上，并將 TSG 在染色體上定位。 4 1） TSG的發(fā)現(xiàn)及其研究途徑（ TSG存在的證據(jù)） ? 腫瘤的發(fā)生不僅僅涉及顯性癌基因激活，而且還涉及其它隱性基因的功能喪失，這其它基因就是抑癌基因。 3 ? TSG： 在正常情況下對(duì)細(xì)胞的繁殖具有負(fù)調(diào)節(jié)作用，抑制癌基因。2022/3/13 1 1 China Medical University Department of Medical Geics （二） Li fucai 2 腫瘤抑制基因 （ Tumor Suppression GeneTSG） 存在于正常細(xì)胞中能夠抑制細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，對(duì)細(xì)胞的增殖起負(fù)性調(diào)節(jié)作用的基因，其失活使正常細(xì)胞增殖失控，進(jìn)而轉(zhuǎn)化形成腫瘤細(xì)胞。 ? Sager于 1990年指出，在癌的發(fā)生過(guò)程中，需要基因改變，即 癌基因的激活和抑癌基因的失活或丟失 ，二者在細(xì)胞繁殖的調(diào)控中起著正負(fù)信號(hào)的調(diào)節(jié)作用。 5 ① 細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn) ? Harris（ 1971年）和 Klein等實(shí)驗(yàn) 鼠正常細(xì)胞 腫瘤細(xì)胞 喪失成瘤性 鼠 雜種細(xì)胞（表型正常） 繼續(xù)培養(yǎng) 形成腫瘤 鼠 出現(xiàn)逆分化（腫瘤表型） 腫瘤的抑制與正常染色體存在著相關(guān)性，正常染色體上有抑制腫瘤效應(yīng)的遺傳物質(zhì) —— TSG。 7 例 如： 腫瘤細(xì)胞 轉(zhuǎn)移染色體 腫瘤生長(zhǎng)抑制 ? 視網(wǎng)膜母 C瘤 13 + ? Wilms 11 + ? 神經(jīng)母細(xì)胞瘤 17 + 8 ③ 家族性癌的研究 A。 ? WT1 10個(gè)外顯子， 50kb，傳錄本 3kb，編碼 46～ 49Ａ a的蛋白質(zhì)。 ? LOH：雜合時(shí)某一等位基因片段丟失。 LOH 的方法鑒定了 p53 Gene，位于 17p12 APC Gene位于 5q21 等 ? LOH MI（ Microsatellite instability） N T N T LOH MI 22 2） TSG 的功能 ? TSG 參與細(xì)胞周期復(fù)雜調(diào)控等，即作為一種負(fù)性調(diào)節(jié)因子（ negative regulation）。對(duì)控制細(xì)胞增殖起重要作用。 ? C、 MDM2癌基因與 pRb結(jié)合并抑制 pRb，而有利細(xì)胞周期進(jìn)展。 B、參于細(xì)胞周期 G1/S階段的 Checkpoint（細(xì)胞缺少 p53或含有其突變時(shí)，就不能停止于 G1期），而損傷 DNA的復(fù)制可導(dǎo)致遺傳的變化。證明缺乏 p53的細(xì)胞不能進(jìn)行凋亡。 LOH DNA MI 35 增變基因 ? 1993年 Fishel在 yeast中發(fā)現(xiàn) ,并將 MutHLS基因稱為 mutater gene。 ? Fishel等克隆了人的這一同源基因， Muts,并定位于 2P，并迅速鑒定了另三個(gè)這樣基因。 ? MutS—— 其蛋白的作用是識(shí)別錯(cuò)配的堿基位點(diǎn)并與 之結(jié)合。 ①修復(fù)： 修復(fù) DNA復(fù)制過(guò)程中出現(xiàn)的堿 作用 基錯(cuò)配。 43 人類 MMR基因定位： Gene location Exon ORF 產(chǎn)物 HMSH2 2p16 16 2802bp 934 aa HMLH1 19 2268bp 756 aa HPMS1 2q31q33 ? 2795bp 932aa HPMS2 2p22 ? 2586bp 862aa 44 人類 MMR系統(tǒng)與腫瘤 ? DNA 錯(cuò)配修復(fù)基因的完整性對(duì)確保 DNA復(fù)制的精確性極為重要 。 47 4 .腫瘤轉(zhuǎn)移基因和轉(zhuǎn)移抑制基因 ? 某些腫瘤發(fā)展到一定階段可發(fā)生轉(zhuǎn)移，惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，包括癌細(xì)胞由原發(fā)性脫落，進(jìn)入細(xì)胞外基質(zhì)和血管或淋巴管，并在遠(yuǎn)處適宜的組織中生長(zhǎng)。 ? 1989年從轉(zhuǎn)移性小鼠乳腺癌細(xì)胞中分離出一種與轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因 —— S100A4(又稱為 CAL 、 p9ka、 mtsI)。 50 2）腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因 ? 又在人和小鼠中發(fā)現(xiàn)， nm23基因 的表達(dá)與乳腺癌等腫瘤的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。定位于 1q32， 4個(gè) exon,編碼 164個(gè)氨基酸。 約 50%的中、晚期腺瘤， 10%早期腺瘤有 Kras的突變 —— 與早、中期腺瘤演進(jìn)有關(guān)。同時(shí)由于 “ 增變基因 ” 的作用 ,通過(guò)其一般突變率使其每一轉(zhuǎn)化成為可能 。 57 發(fā)現(xiàn)端粒和端粒酶是如何保護(hù)染色體的”。在人類大約有 12～ 15Kb，是非結(jié)構(gòu)基因，不編碼蛋白質(zhì)。 隨著細(xì)胞分裂的不斷進(jìn)行，端粒逐漸縮短。 61 影響端粒長(zhǎng)度的因素很多，其中主要有： ? ① 端粒結(jié)合蛋白 ? ② 端粒帽蛋白 ? ③ DNA復(fù)制酶 ? ④ 端粒酶等 ? 其中端粒酶是最主要因素。 64 ? 利用 TRAP（ Telemeric Repeat Amplification Protocol）技術(shù)檢測(cè)正常動(dòng)物、植物細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn)，除個(gè)別增生活躍的組織有微弱的端粒酶活性外，其他組織都沒(méi)有端粒酶活性。正常情況下，一旦胚胎發(fā)育階段結(jié)束，除了 成體干細(xì)胞 之外，體內(nèi)的細(xì)胞就停止產(chǎn)生端粒酶。但是細(xì)胞永生化在 90%已知的癌癥中是腫瘤形成的一個(gè)關(guān)鍵因素。這種蛋白復(fù)合物有點(diǎn)類似于蓋子，阻止端粒酶在端粒上發(fā)揮作用。 ? 在惡性腫瘤中，端粒酶活性明顯增高，以延長(zhǎng)端粒，彌補(bǔ)因細(xì)胞分裂而造成的端?？s短，從而使細(xì)胞無(wú)限增殖惡化，甚至使癌細(xì)胞永生化。揭示，端粒酶可能是一個(gè)廣泛的腫瘤標(biāo)致，可用于腫瘤的診斷。 ? 7脫氮 2脫氧腺 /鳥(niǎo)苷酸（ 7deazad A/GTP ）是潛在的端粒酶抑制劑，二者都可通過(guò)端粒酶的催化作用慘入到端粒 DNA中，由于它們的摻入使端粒過(guò)早地縮短，開(kāi)僻了腫瘤治療的新途徑。 ? 這種轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制 (posttranscriptional gene silencing, PTGS)被稱為 RNA干擾（ RNAi）。 81 82 ? 在 RNAi效應(yīng)階段 siRNA雙鏈結(jié)合一個(gè)核酶復(fù)合物從而形成所謂 RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物（ RNAinduced silencing plex, RISC）。 以 DNA Oligo為模版，通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄合成 siRNAs。 85 86 87 (三 )siRNA的轉(zhuǎn)染 將氯化鈣， RNA(或 DNA)和磷酸緩沖液混合，沉淀形成包含 DNA且極小的不溶的磷酸鈣顆粒。 88 polybrene 帶正電的 DEAE葡聚糖或 polybrene多聚體復(fù)合物和帶負(fù)電的 DNA分子使得 DNA可以結(jié)合在細(xì)胞表面。被俘獲的 DNA就會(huì)被導(dǎo)入培養(yǎng)的細(xì)胞。 RNAi的應(yīng)用前景 90 2. 研究信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的新途徑 ? 聯(lián)合利用傳統(tǒng)的缺失突變技術(shù)和 RNAi技術(shù) ,可以很容易地 確定復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中不同基因的上下游關(guān)系。因此，可以利用 RNAi現(xiàn)象產(chǎn)生抗病毒的植物和動(dòng)物，并可利用不同病毒轉(zhuǎn)錄序列中高度同源區(qū)段相應(yīng)的 dsRNA抵抗多種病毒。 93 RNA的分類 細(xì)胞核和胞液 線粒體 功能 核蛋白體 RNA rRNA mt rRNA 核蛋白體組成成分 信使 RNA mRNA mt mRNA 蛋白質(zhì)合成模板 轉(zhuǎn)運(yùn) RNA tRNA mt tRNA 轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸 不均一核 RNA hnRNA 成熟 mRNA的前體 小核 RNA snRNA 參與 hnRNA的剪接、轉(zhuǎn)運(yùn) 小胞漿 R