【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 期腺瘤演進(jìn)有關(guān)。 約 50%晚期腺瘤與癌有 18q雜合丟失（這在早期、中期腺瘤是不常見(jiàn)的）。即 DCC（ Deleted in colon cancer）的丟失突變有關(guān)。 直腸癌有高頻率的 p53的突變。同時(shí)由于 “ 增變基因 ” 的作用 ,通過(guò)其一般突變率使其每一轉(zhuǎn)化成為可能 。 56 六、研究熱點(diǎn) 端粒和端粒酶 ? 端粒（ telomere）： 是真核細(xì)胞染色體末端的一種特殊結(jié)構(gòu)，由端粒 DNA和蛋白質(zhì)組成。其端粒 DNA是富含 G的高度 保守的重復(fù)核苷酸序列。對(duì)染色體具有保護(hù)作用。 57 發(fā)現(xiàn)端粒和端粒酶是如何保護(hù)染色體的”。他們的研究成果揭 示端粒變短，細(xì)胞就老化 。 美國(guó) 3名科學(xué)家獲諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)， 2022。 伊麗莎白 布萊克本 卡蘿爾 格雷德 杰克 紹斯塔克 58 ? 不同物種的端粒 DNA 序列并不一致，人和其它哺乳動(dòng)物的端粒 DNA序列由 5ˊ —— 3ˊ 方向的（ TTAGGG） n反復(fù)串聯(lián)組成。在人類大約有 12～ 15Kb，是非結(jié)構(gòu)基因，不編碼蛋白質(zhì)。 ? 端粒 DNA的 3ˊ 末端較 5ˊ 末端伸出 12～ 16bp 的一段彎曲呈帽狀結(jié)構(gòu)，保護(hù)染色體，防止斷裂、重組或降解，促進(jìn)染色體與核膜粘著，以及減數(shù)分裂時(shí)同源染色體配對(duì)。 ? 每條染色體的末端含有一段被稱作 端粒 的特殊 DNA序列，它的長(zhǎng)度受到端粒酶的調(diào)節(jié)。端粒的序列長(zhǎng)度代表著一個(gè)細(xì)胞的壽命。 隨著細(xì)胞分裂的不斷進(jìn)行，端粒逐漸縮短。當(dāng)其長(zhǎng)度減小到一定臨界值時(shí)，細(xì)胞趨向衰老、死亡。 ? 端粒被認(rèn)為是細(xì)胞有絲分裂的“生物鐘”。 60 端粒 DNA 逐漸變短的主要原因： ? 細(xì)胞分裂過(guò)程中線形染色體的末端端粒DNA不能完全被 DNA指導(dǎo) DNA多聚酶所復(fù)制； ? 末端的特異性和非特異性降解； ? 細(xì)胞異源端粒之間的不均勻重組。 61 影響端粒長(zhǎng)度的因素很多，其中主要有： ? ① 端粒結(jié)合蛋白 ? ② 端粒帽蛋白 ? ③ DNA復(fù)制酶 ? ④ 端粒酶等 ? 其中端粒酶是最主要因素。 ? 端粒酶（ telomerase）： ? 是一種逆轉(zhuǎn)錄酶，能延長(zhǎng)端粒末端， 由蛋白質(zhì)和 RNA 組成 ，可以其 RNA為模板指導(dǎo) DNA合成，向端粒末端添加（ TTAGGG） n序列，使端粒延長(zhǎng)，延長(zhǎng)細(xì)胞的壽命甚至使其永生化。 62 端粒合成機(jī)制 63 G1/S期 ， 端粒酶活性逐漸增高 S期 活性最高。 在 G2期 /M期 端粒酶活性逐漸消失。 64 ? 利用 TRAP（ Telemeric Repeat Amplification Protocol）技術(shù)檢測(cè)正常動(dòng)物、植物細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn)，除個(gè)別增生活躍的組織有微弱的端粒酶活性外，其他組織都沒(méi)有端粒酶活性。但在腫瘤細(xì)胞、永生型細(xì)胞及干細(xì)胞（如造血干細(xì)胞）中，端粒酶可被激活，活性增強(qiáng)。 ? 細(xì)胞永生化 (cellular immortality)導(dǎo)致癌癥形成，而且重新具備在胚胎發(fā)育中的細(xì)胞才有的一種關(guān)鍵功能： 端粒 長(zhǎng)度不縮短 。 ? 細(xì)胞永生化是癌癥的共同特征。正常情況下，一旦胚胎發(fā)育階段結(jié)束，除了 成體干細(xì)胞 之外，體內(nèi)的細(xì)胞就停止產(chǎn)生端粒酶。但是，細(xì)胞偶爾發(fā)生突變而重新 激活端粒酶 ，這樣當(dāng)細(xì)胞分裂時(shí)端粒就變長(zhǎng)而不是縮短。這就是癌細(xì)胞永生化的形成機(jī)制。 端粒酶與腫瘤 ? 這種突變本身并不足以導(dǎo)致癌癥產(chǎn)生。但是細(xì)胞永生化在 90%已知的癌癥中是腫瘤形成的一個(gè)關(guān)鍵因素。 ? 令人感興趣的是，即便在癌細(xì)胞中，端粒也不會(huì)無(wú)限制地變長(zhǎng)。在每次細(xì)胞分裂時(shí)，癌細(xì)胞與大多數(shù)細(xì)胞一樣丟失大約 60個(gè)核苷酸，但是活化的端粒酶給它補(bǔ)回一樣多的核苷酸，然后內(nèi)部時(shí)鐘被重置為零，它就永生化。 ? 但是這里就存在一個(gè)問(wèn)題：是什么阻止端粒無(wú)限制變長(zhǎng)？ ? 瑞士 Joachim Lingner教授 給出這個(gè)問(wèn)題的答案：他們鑒定出三個(gè)蛋白連接在一起而形成一種蛋白復(fù)合物，然后附著到端粒上。這種蛋白復(fù)合物有點(diǎn)類似于蓋子，阻止端粒酶在端粒上發(fā)揮作用。但是在癌細(xì)胞中，它們的作用時(shí)間不對(duì)，即它們參與的時(shí)間太晚了。 ? Ligner解釋，“ 如果我們能夠讓這些蛋白在更早的時(shí)間發(fā)揮作用，或者我們能夠重新構(gòu)建一種類似的機(jī)制，癌細(xì)胞就不再永生化。”這樣，癌細(xì)胞就能夠像正常細(xì)胞那樣死亡。 ? 在惡性腫瘤中，端粒酶活性明顯增高，以延長(zhǎng)端粒，彌補(bǔ)因細(xì)胞分裂而造成的端?？s短，從而使細(xì)胞無(wú)限增殖惡化，甚至使癌細(xì)胞永生化。 ? Ueda報(bào)道（ 1997， Cancer Res.），在惡性腫瘤中 91%端粒酶活性增強(qiáng)。 ? Zheng ，報(bào)道，婦科腫瘤中端粒酶活性增強(qiáng)的占 95%。 69 上述情況表明，絕大多數(shù)腫瘤細(xì)胞中都呈端粒酶陽(yáng)性，而在正常組織中卻無(wú)表達(dá)。揭示，端粒酶可能是一個(gè)廣泛的腫瘤標(biāo)致，可用于腫瘤的診斷。 ? Hiyama E （ 1997， CancerRes），通過(guò)檢測(cè)胰腺腫瘤得出： 95%胰腺癌中端粒酶活性增強(qiáng)，而在良性胰腺瘤中為 0%。 ? 哪么能否應(yīng)用抑制端粒酶的手段來(lái)治療腫瘤呢？ 這個(gè)問(wèn)題正是目前人們關(guān)注的問(wèn)題，也是研究的熱點(diǎn)。 70 研究者們建議利用端粒酶抑制劑進(jìn)行腫瘤治療。 ? 7脫氮 2脫氧腺 /鳥(niǎo)苷酸（ 7deazad A/GTP ）是潛在的端粒酶抑制劑，二者都可通過(guò)端粒酶的催化作用慘入到端粒 DNA中，由于它們的摻入使端粒過(guò)早地縮短，開(kāi)僻了腫瘤治療的新途徑。 ? Kanazawa 制備一種錘頭核酸酶 telorz，作用于人類端粒酶的 RNA成分，對(duì)已合成的端粒酶 RNA成分具有特異分解作用，對(duì)端粒酶有明顯的抑制作用。 ? 應(yīng)用反義核酸治療方法，人工合成反義DNA/RNA 抑制端粒酶的作用 。 71 核酶 Ribozyme 72 核酶 73 RNA干擾 ? 近年來(lái)的研究表明 ? 將與 mRNA對(duì)應(yīng)的正義 RNA和反義 RNA組成的雙鏈 RNA(dsRNA)導(dǎo)入細(xì)胞，可以使 mRNA發(fā)生特異性的降解，導(dǎo)致其相應(yīng)的基因沉默。 ? 這種轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制 (posttranscriptional gene silencing, PTGS)被稱為 RNA干擾（ RNAi）。 74 75 GFP報(bào)告基因 RNAi 76 RNAi機(jī)制 77 78 79 RNA干擾 05/11/18 cell wangxiaodong 80 RNAi的分子機(jī)制 ? RNA干擾包括 起始階段和效應(yīng)階段 (inititation and effector steps)。 ? 在起始階段 加入的小分子 RNA被切割為 2123核苷酸長(zhǎng)的小分子干擾 RNA片段 (small interfering RNAs, siRNAs)。 ? 證據(jù)表明；一個(gè)稱為 Dicer的酶，是 RNase III家族中特異識(shí)別雙鏈 RNA的一員，它能以一種 ATP依賴的方式逐步切割由外源導(dǎo)入或者由轉(zhuǎn)基因，病毒感染等各種方式引入的雙鏈 RNA，將 RNA降解為2123bp的雙鏈 RNAs(siRNAs)，每個(gè)片段的 3’端都有 2個(gè)堿基突出。 81 82 ? 在 RNAi效應(yīng)階段 siRNA雙鏈結(jié)合一個(gè)核酶復(fù)合物從而形成所謂 RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物（ RNAinduced silencing plex, RISC）。 ? 激活 RISC需要一個(gè) ATP依賴的將小分子 RNA解雙鏈的過(guò)程。激活的 RISC通過(guò)堿基配對(duì)定位到同源mRNA轉(zhuǎn)錄本上，并在距離 siRNA3’ 端 12個(gè)堿基的位置切割 mRNA。 ? 盡管切割的確切機(jī)制尚不明了，但每個(gè) RISC都包含一個(gè) siRNA和一個(gè)不同于 Dicer的 RNA酶 (Ago2) 83 如何進(jìn)行 RNAi試驗(yàn) (一 )siRNA的設(shè)計(jì) 在設(shè)計(jì) RNAi實(shí)驗(yàn)時(shí)，可以先在以下網(wǎng)站進(jìn)行目標(biāo)序列的篩選： tm tml x?SID=45358710 84 (二 )siRNA的制備 公司都可以根據(jù)用戶要求提供高質(zhì)量的化學(xué)合成 siRNA。 以 DNA Oligo為模版，通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄合成 siRNAs。 RNase III 消化長(zhǎng)片斷雙鏈 RNA制備 siRNA dsRNA消化法的主要優(yōu)點(diǎn)在于可以跳過(guò)檢測(cè)和篩選有效siRNA序列的。 4. siRNA表達(dá)載體 siRNA表達(dá)載體的優(yōu)點(diǎn)在于可以進(jìn)行較長(zhǎng)期研究 —— 帶有抗生素標(biāo)記的載體可以在細(xì)胞中持續(xù)抑制靶基因的表達(dá)，持續(xù)數(shù)星期甚至更久。 5. siRNA表達(dá)框架 siRNA表達(dá)框架 (siRNA expression cassettes， SECs)是一種由 PCR得到的 siRNA表達(dá)模版，包括一個(gè) RNA pol III啟動(dòng)子，一段發(fā)夾結(jié)構(gòu) siRNA，一個(gè) RNA pol III終止位點(diǎn)，能夠直接導(dǎo)入細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)而無(wú)需事前克隆到載體中。 85 86 87 (三 )siRNA的轉(zhuǎn)染 將氯化鈣， RNA(或 DNA)和磷酸緩沖液混合，沉淀形成包含 DNA且極小的不溶的磷酸鈣顆粒。磷酸鈣 DNA復(fù)合物粘附到細(xì)胞膜并通過(guò)胞飲進(jìn)入目的細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)。 電穿孔通過(guò)將細(xì)胞暴露在短暫的高場(chǎng)強(qiáng)電脈沖中轉(zhuǎn)導(dǎo)分子。將細(xì)胞懸浮液置于電場(chǎng)中會(huì)誘導(dǎo)沿細(xì)胞膜的電壓差異，據(jù)認(rèn)為這種電壓差異會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜暫時(shí)穿孔。 88 polybrene 帶正電的 DEAE葡聚糖或 polybrene多聚體復(fù)合物和帶負(fù)電的 DNA分子使得 DNA可以結(jié)合在細(xì)胞表面。通過(guò)使用 DMSO或甘油獲得的滲透休克將 DNA復(fù)合體導(dǎo)入。 轉(zhuǎn)染技術(shù)也包括使用機(jī)械的方法，比如顯微注射和基因槍（ biolistic particle）將 DNA， RNA或蛋白直接轉(zhuǎn)入細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核。 形成 DNA陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物。被俘獲的 DNA就會(huì)被導(dǎo)入培養(yǎng)的細(xì)胞。 89 ? 1. 研究基因功能的新工具 ? 已有研究表明 RNAi能夠在哺乳動(dòng)物中滅活或降低特異性基因的表達(dá)，制作多種表型，而且抑制基因表達(dá)的時(shí)間可以隨意控制在發(fā)育的任何階段，產(chǎn)生類似基因敲除的效應(yīng)。 ? RNAi將大大促進(jìn)對(duì)這些新基因功能的研究。與傳統(tǒng)的基因敲除技術(shù)相比，這一技術(shù)具有投入少，周期短，操作簡(jiǎn)單等優(yōu)勢(shì)，近來(lái) RNAi成功用于構(gòu)建轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型的報(bào)道日益