【文章內容簡介】 期腺瘤演進有關。 約 50%晚期腺瘤與癌有 18q雜合丟失（這在早期、中期腺瘤是不常見的）。即 DCC（ Deleted in colon cancer）的丟失突變有關。 直腸癌有高頻率的 p53的突變。同時由于 “ 增變基因 ” 的作用 ,通過其一般突變率使其每一轉化成為可能 。 56 六、研究熱點 端粒和端粒酶 ? 端粒（ telomere）： 是真核細胞染色體末端的一種特殊結構，由端粒 DNA和蛋白質組成。其端粒 DNA是富含 G的高度 保守的重復核苷酸序列。對染色體具有保護作用。 57 發(fā)現(xiàn)端粒和端粒酶是如何保護染色體的”。他們的研究成果揭 示端粒變短，細胞就老化 。 美國 3名科學家獲諾貝爾生理學或醫(yī)學獎， 2022。 伊麗莎白 布萊克本 卡蘿爾 格雷德 杰克 紹斯塔克 58 ? 不同物種的端粒 DNA 序列并不一致，人和其它哺乳動物的端粒 DNA序列由 5ˊ —— 3ˊ 方向的（ TTAGGG） n反復串聯(lián)組成。在人類大約有 12～ 15Kb，是非結構基因，不編碼蛋白質。 ? 端粒 DNA的 3ˊ 末端較 5ˊ 末端伸出 12～ 16bp 的一段彎曲呈帽狀結構，保護染色體，防止斷裂、重組或降解，促進染色體與核膜粘著，以及減數分裂時同源染色體配對。 ? 每條染色體的末端含有一段被稱作 端粒 的特殊 DNA序列，它的長度受到端粒酶的調節(jié)。端粒的序列長度代表著一個細胞的壽命。 隨著細胞分裂的不斷進行，端粒逐漸縮短。當其長度減小到一定臨界值時，細胞趨向衰老、死亡。 ? 端粒被認為是細胞有絲分裂的“生物鐘”。 60 端粒 DNA 逐漸變短的主要原因： ? 細胞分裂過程中線形染色體的末端端粒DNA不能完全被 DNA指導 DNA多聚酶所復制； ? 末端的特異性和非特異性降解； ? 細胞異源端粒之間的不均勻重組。 61 影響端粒長度的因素很多，其中主要有： ? ① 端粒結合蛋白 ? ② 端粒帽蛋白 ? ③ DNA復制酶 ? ④ 端粒酶等 ? 其中端粒酶是最主要因素。 ? 端粒酶（ telomerase）： ? 是一種逆轉錄酶，能延長端粒末端， 由蛋白質和 RNA 組成 ，可以其 RNA為模板指導 DNA合成，向端粒末端添加（ TTAGGG） n序列，使端粒延長，延長細胞的壽命甚至使其永生化。 62 端粒合成機制 63 G1/S期 ， 端粒酶活性逐漸增高 S期 活性最高。 在 G2期 /M期 端粒酶活性逐漸消失。 64 ? 利用 TRAP（ Telemeric Repeat Amplification Protocol）技術檢測正常動物、植物細胞時發(fā)現(xiàn)，除個別增生活躍的組織有微弱的端粒酶活性外，其他組織都沒有端粒酶活性。但在腫瘤細胞、永生型細胞及干細胞（如造血干細胞）中，端粒酶可被激活，活性增強。 ? 細胞永生化 (cellular immortality)導致癌癥形成，而且重新具備在胚胎發(fā)育中的細胞才有的一種關鍵功能： 端粒 長度不縮短 。 ? 細胞永生化是癌癥的共同特征。正常情況下，一旦胚胎發(fā)育階段結束，除了 成體干細胞 之外，體內的細胞就停止產生端粒酶。但是，細胞偶爾發(fā)生突變而重新 激活端粒酶 ，這樣當細胞分裂時端粒就變長而不是縮短。這就是癌細胞永生化的形成機制。 端粒酶與腫瘤 ? 這種突變本身并不足以導致癌癥產生。但是細胞永生化在 90%已知的癌癥中是腫瘤形成的一個關鍵因素。 ? 令人感興趣的是，即便在癌細胞中，端粒也不會無限制地變長。在每次細胞分裂時，癌細胞與大多數細胞一樣丟失大約 60個核苷酸，但是活化的端粒酶給它補回一樣多的核苷酸，然后內部時鐘被重置為零，它就永生化。 ? 但是這里就存在一個問題：是什么阻止端粒無限制變長？ ? 瑞士 Joachim Lingner教授 給出這個問題的答案：他們鑒定出三個蛋白連接在一起而形成一種蛋白復合物，然后附著到端粒上。這種蛋白復合物有點類似于蓋子，阻止端粒酶在端粒上發(fā)揮作用。但是在癌細胞中，它們的作用時間不對，即它們參與的時間太晚了。 ? Ligner解釋，“ 如果我們能夠讓這些蛋白在更早的時間發(fā)揮作用，或者我們能夠重新構建一種類似的機制，癌細胞就不再永生化?！边@樣，癌細胞就能夠像正常細胞那樣死亡。 ? 在惡性腫瘤中，端粒酶活性明顯增高，以延長端粒，彌補因細胞分裂而造成的端?？s短，從而使細胞無限增殖惡化，甚至使癌細胞永生化。 ? Ueda報道（ 1997， Cancer Res.），在惡性腫瘤中 91%端粒酶活性增強。 ? Zheng ，報道，婦科腫瘤中端粒酶活性增強的占 95%。 69 上述情況表明，絕大多數腫瘤細胞中都呈端粒酶陽性，而在正常組織中卻無表達。揭示，端粒酶可能是一個廣泛的腫瘤標致，可用于腫瘤的診斷。 ? Hiyama E （ 1997， CancerRes），通過檢測胰腺腫瘤得出： 95%胰腺癌中端粒酶活性增強，而在良性胰腺瘤中為 0%。 ? 哪么能否應用抑制端粒酶的手段來治療腫瘤呢？ 這個問題正是目前人們關注的問題，也是研究的熱點。 70 研究者們建議利用端粒酶抑制劑進行腫瘤治療。 ? 7脫氮 2脫氧腺 /鳥苷酸（ 7deazad A/GTP ）是潛在的端粒酶抑制劑，二者都可通過端粒酶的催化作用慘入到端粒 DNA中，由于它們的摻入使端粒過早地縮短，開僻了腫瘤治療的新途徑。 ? Kanazawa 制備一種錘頭核酸酶 telorz，作用于人類端粒酶的 RNA成分，對已合成的端粒酶 RNA成分具有特異分解作用，對端粒酶有明顯的抑制作用。 ? 應用反義核酸治療方法，人工合成反義DNA/RNA 抑制端粒酶的作用 。 71 核酶 Ribozyme 72 核酶 73 RNA干擾 ? 近年來的研究表明 ? 將與 mRNA對應的正義 RNA和反義 RNA組成的雙鏈 RNA(dsRNA)導入細胞，可以使 mRNA發(fā)生特異性的降解，導致其相應的基因沉默。 ? 這種轉錄后基因沉默機制 (posttranscriptional gene silencing, PTGS)被稱為 RNA干擾（ RNAi）。 74 75 GFP報告基因 RNAi 76 RNAi機制 77 78 79 RNA干擾 05/11/18 cell wangxiaodong 80 RNAi的分子機制 ? RNA干擾包括 起始階段和效應階段 (inititation and effector steps)。 ? 在起始階段 加入的小分子 RNA被切割為 2123核苷酸長的小分子干擾 RNA片段 (small interfering RNAs, siRNAs)。 ? 證據表明；一個稱為 Dicer的酶，是 RNase III家族中特異識別雙鏈 RNA的一員，它能以一種 ATP依賴的方式逐步切割由外源導入或者由轉基因，病毒感染等各種方式引入的雙鏈 RNA，將 RNA降解為2123bp的雙鏈 RNAs(siRNAs)，每個片段的 3’端都有 2個堿基突出。 81 82 ? 在 RNAi效應階段 siRNA雙鏈結合一個核酶復合物從而形成所謂 RNA誘導沉默復合物（ RNAinduced silencing plex, RISC）。 ? 激活 RISC需要一個 ATP依賴的將小分子 RNA解雙鏈的過程。激活的 RISC通過堿基配對定位到同源mRNA轉錄本上，并在距離 siRNA3’ 端 12個堿基的位置切割 mRNA。 ? 盡管切割的確切機制尚不明了，但每個 RISC都包含一個 siRNA和一個不同于 Dicer的 RNA酶 (Ago2) 83 如何進行 RNAi試驗 (一 )siRNA的設計 在設計 RNAi實驗時，可以先在以下網站進行目標序列的篩選： tm tml x?SID=45358710 84 (二 )siRNA的制備 公司都可以根據用戶要求提供高質量的化學合成 siRNA。 以 DNA Oligo為模版，通過體外轉錄合成 siRNAs。 RNase III 消化長片斷雙鏈 RNA制備 siRNA dsRNA消化法的主要優(yōu)點在于可以跳過檢測和篩選有效siRNA序列的。 4. siRNA表達載體 siRNA表達載體的優(yōu)點在于可以進行較長期研究 —— 帶有抗生素標記的載體可以在細胞中持續(xù)抑制靶基因的表達，持續(xù)數星期甚至更久。 5. siRNA表達框架 siRNA表達框架 (siRNA expression cassettes， SECs)是一種由 PCR得到的 siRNA表達模版，包括一個 RNA pol III啟動子，一段發(fā)夾結構 siRNA，一個 RNA pol III終止位點，能夠直接導入細胞進行表達而無需事前克隆到載體中。 85 86 87 (三 )siRNA的轉染 將氯化鈣， RNA(或 DNA)和磷酸緩沖液混合，沉淀形成包含 DNA且極小的不溶的磷酸鈣顆粒。磷酸鈣 DNA復合物粘附到細胞膜并通過胞飲進入目的細胞的細胞質。 電穿孔通過將細胞暴露在短暫的高場強電脈沖中轉導分子。將細胞懸浮液置于電場中會誘導沿細胞膜的電壓差異，據認為這種電壓差異會導致細胞膜暫時穿孔。 88 polybrene 帶正電的 DEAE葡聚糖或 polybrene多聚體復合物和帶負電的 DNA分子使得 DNA可以結合在細胞表面。通過使用 DMSO或甘油獲得的滲透休克將 DNA復合體導入。 轉染技術也包括使用機械的方法，比如顯微注射和基因槍（ biolistic particle）將 DNA， RNA或蛋白直接轉入細胞質或細胞核。 形成 DNA陽離子脂質體復合物。被俘獲的 DNA就會被導入培養(yǎng)的細胞。 89 ? 1. 研究基因功能的新工具 ? 已有研究表明 RNAi能夠在哺乳動物中滅活或降低特異性基因的表達，制作多種表型，而且抑制基因表達的時間可以隨意控制在發(fā)育的任何階段，產生類似基因敲除的效應。 ? RNAi將大大促進對這些新基因功能的研究。與傳統(tǒng)的基因敲除技術相比，這一技術具有投入少，周期短，操作簡單等優(yōu)勢，近來 RNAi成功用于構建轉基因動物模型的報道日益