[基礎(chǔ)醫(yī)學]核酸疫苗及免疫研究進展(已修改)
2025-03-06 00:53 本頁面
【正文】 核酸疫苗 LOGO Diagram 4 核酸疫苗定義 1 2 3 5 核酸疫苗的發(fā)展史 核酸疫苗的作用原理 核酸疫苗的構(gòu)建 核酸疫苗的優(yōu)缺點和應(yīng)用現(xiàn)狀 疫苗 是將病原微生物（如細菌、立克次氏體、病毒等）及其代謝產(chǎn)物，經(jīng)過人工減毒、滅活或利用基因工程等方法制成的用于預(yù)防傳染病的自動免疫制劑。 人們將多種滅活或減毒疫苗稱為 第一代疫苗 。 將用基因工程的方法研制的亞單位疫苗稱為 第二代疫苗 。 理想疫苗應(yīng)具備的特征有：安全、廉價、熱穩(wěn)定性好，含有多種具有保護作用的免疫原，最好是一次口服即可生效。目前前兩代均不能滿足上述標準。故基因疫苗應(yīng)運而生。 基因疫苗被稱為 第三代疫苗 。 ? 1990年 wolff等從事于基因治療工作時，用外源性重組質(zhì)粒給小鼠肌肉注射后，質(zhì)粒被攝取并能在體內(nèi)至少兩個月穩(wěn)定地表達所編碼蛋白。 ? 1991年 Williams等發(fā)現(xiàn)外源基因輸入體內(nèi)的表達產(chǎn)物可誘導產(chǎn)生免疫應(yīng)答。 ? 1992年 Tang等將表達人生長激素的基因質(zhì)粒 DNA導入小鼠皮內(nèi)，小鼠產(chǎn)生特異性抗體，從而提出了基因免疫的概念。 ? 1993年 Ulmer等將注射技術(shù)用于研究流感核酸疫苗，證實核酸注射不但能在體內(nèi)表達抗原蛋白，還可以誘導具有顯著保護作用的免疫應(yīng)答。 ? 因此， 1994年在日內(nèi)瓦召開的專題會議上將這種疫苗定名為核酸疫苗。 關(guān)于核酸免疫的國際會議 ? 1994年 5月 1718日，瑞士日內(nèi)瓦。WHO主辦。主題：核酸疫苗。 ? 1995年 2月 1617日，美國馬里蘭州，Bethesda（ NIH）。主題：基因疫苗和核酸疫苗戰(zhàn)略。 ? 1995年 4月 69日，美國弗吉尼亞州。主題： DNA疫苗：疫苗學的新時代。 ? 1996年 2月 58日，美國馬里蘭州 NIH Natcher會議中心。主題：核酸疫苗預(yù)防傳染性疾病和控制核酸疫苗。 定義 核酸疫苗 (nucleic acid vaccine),也稱基因疫苗 (geic vaccine),是指一類將抗原基因重組到表達載體上的重組質(zhì)粒疫苗，經(jīng) 肌肉注射 或黏膜免疫等方法導入宿主體內(nèi)，通過宿主細胞表達抗原蛋白，誘導宿主細胞產(chǎn)生對該抗原蛋白的免疫應(yīng)答，以達到預(yù)防和治療疾病的目的。 基因疫苗的構(gòu)建 基因疫苗構(gòu)建的基本途徑 基因疫苗的構(gòu)建 一、構(gòu)建基因疫苗的載體 載體是將抗原基因?qū)氲綑C體細胞的必要工具。 按照載體功能可分為克隆載體和表達載體； 按照載體來源可分為質(zhì)粒、噬菌體、黏粒和病毒載體等。 、 、 （ +/）、 pcDNA pcDNA4/HisMAX、 pBudCE pRc/RSV 、 pRc/CMV2等多種 基因疫苗的構(gòu)建 二、基因疫苗的構(gòu)建方法 獲得需要的目的基因常用的方法： （ 1）直接從生物體中提取總 DNA，構(gòu)建基因組 DNA文庫 (genomic DNA library)，從中調(diào)用目的基因； （ 2）以 mRNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成互補的DNA片段，建立 cDNA文庫； （ 3）利用聚合酶鏈式反應(yīng)（ PCR）特異性地擴增所需要的目的基因片段，等等。 （ 4）化學合成 基因疫苗的構(gòu)建 基因表達載體的組成： 復(fù)制原點 +啟動子 +目的基因 +終止子 +標記基因 為了保證抗原基因的定向正確插入，只有以正確的方向插入表達載體讀框啟動子下游才能表達抗原基因，故抗原基因兩端應(yīng)具有不同的酶切位點，在設(shè)計時須注意這點。 連接的方式可分為 粘性末端連接 和 平末端連接 兩種，其中前者連接效率較高，使用比較多。連接反應(yīng)時應(yīng)考慮反應(yīng)體積、抗原基因與載體的比例、溫度和時間和酶量。 粘性末端連接 用同一種或兩種 限制性內(nèi)切酶 酶切 DNA連接酶 重組質(zhì)粒 質(zhì)粒 目的基因 本法適用于在質(zhì)粒和目的基 因上有 相同 單或雙酶切位點 平末端連接 質(zhì)粒 產(chǎn)生 平末端 的 內(nèi)切酶 DNA連接酶 核酸酶 S1 目的基因 重組質(zhì)粒 本法適用于在質(zhì)粒 和目的基因上 沒有 相同 的酶切位點！ 基因疫苗的構(gòu)建 轉(zhuǎn)化：將質(zhì)粒或者以它為載體構(gòu)建的重組子導入 細菌 的過程。 轉(zhuǎn)染：將質(zhì)?；蛘咭运鼮檩d體構(gòu)建的重組子導入 真核細胞 的過程。 感受態(tài)：細菌經(jīng)過 CaCl2溶液處理和短暫熱激后，容易攝入外源 DNA，這種狀態(tài)稱為感受態(tài)。其原理是細菌處于 0℃ 、低滲CaCl2溶液中時，細胞壁和細胞膜通透性增加。此時轉(zhuǎn)化混合物中的 DNA形成抗 DNase的羥基 鈣磷酸復(fù)合物黏附于細胞表面，經(jīng)短暫的熱激（ 42 ℃ ）處理后，外源基因容易進入細菌細胞內(nèi)。 常用的方法為氯化鈣共沉淀法和電穿孔法。 基因疫苗的構(gòu)建 一般重組質(zhì)粒鑒定主要按照表型篩選、酶切鑒定和測序鑒定的順序進行 （ 1）插入片段鑒定：酶切鑒定； PCR鑒定。 （ 2）插入片段方向性鑒定：可利用聯(lián)合酶切方案進行目的基因的插入方向鑒定。 （ 3） DNA序列測定：末端終止法測序；自動測序儀測序 基因疫苗的構(gòu)建 三、重組質(zhì)粒在真核細胞中的表達與檢測 磷酸鈣共沉淀法、電穿孔法、脂質(zhì)體介導等方法都可以用來將外源質(zhì)粒導入真核細胞，其中脂質(zhì)體介導容易成功，是最常用的方法。 （ 1）蛋白水平的檢測：免疫沉淀法檢測表達蛋白； Western印跡檢測；酶聯(lián)免疫吸附測定。 （ 2）核酸水平的檢測： RNA印跡； RTPCR檢測。 由于這個過程實際上是相當復(fù)雜的，所以人們對一些具體的細節(jié)并不清楚。下面通過對基因疫苗經(jīng)過肌肉組織和黏膜免疫的抗原呈遞途徑來說明基因疫苗的工作原理。 基因疫苗經(jīng)黏膜和皮膚
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