[基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)]核酸疫苗及免疫研究進(jìn)展(已修改)
2025-03-06 00:53 本頁(yè)面
【正文】 核酸疫苗 LOGO Diagram 4 核酸疫苗定義 1 2 3 5 核酸疫苗的發(fā)展史 核酸疫苗的作用原理 核酸疫苗的構(gòu)建 核酸疫苗的優(yōu)缺點(diǎn)和應(yīng)用現(xiàn)狀 疫苗 是將病原微生物（如細(xì)菌、立克次氏體、病毒等）及其代謝產(chǎn)物，經(jīng)過(guò)人工減毒、滅活或利用基因工程等方法制成的用于預(yù)防傳染病的自動(dòng)免疫制劑。 人們將多種滅活或減毒疫苗稱(chēng)為 第一代疫苗 。 將用基因工程的方法研制的亞單位疫苗稱(chēng)為 第二代疫苗 。 理想疫苗應(yīng)具備的特征有：安全、廉價(jià)、熱穩(wěn)定性好，含有多種具有保護(hù)作用的免疫原，最好是一次口服即可生效。目前前兩代均不能滿足上述標(biāo)準(zhǔn)。故基因疫苗應(yīng)運(yùn)而生。 基因疫苗被稱(chēng)為 第三代疫苗 。 ? 1990年 wolff等從事于基因治療工作時(shí)，用外源性重組質(zhì)粒給小鼠肌肉注射后，質(zhì)粒被攝取并能在體內(nèi)至少兩個(gè)月穩(wěn)定地表達(dá)所編碼蛋白。 ? 1991年 Williams等發(fā)現(xiàn)外源基因輸入體內(nèi)的表達(dá)產(chǎn)物可誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫應(yīng)答。 ? 1992年 Tang等將表達(dá)人生長(zhǎng)激素的基因質(zhì)粒 DNA導(dǎo)入小鼠皮內(nèi)，小鼠產(chǎn)生特異性抗體，從而提出了基因免疫的概念。 ? 1993年 Ulmer等將注射技術(shù)用于研究流感核酸疫苗，證實(shí)核酸注射不但能在體內(nèi)表達(dá)抗原蛋白，還可以誘導(dǎo)具有顯著保護(hù)作用的免疫應(yīng)答。 ? 因此， 1994年在日內(nèi)瓦召開(kāi)的專(zhuān)題會(huì)議上將這種疫苗定名為核酸疫苗。 關(guān)于核酸免疫的國(guó)際會(huì)議 ? 1994年 5月 1718日，瑞士日內(nèi)瓦。WHO主辦。主題：核酸疫苗。 ? 1995年 2月 1617日，美國(guó)馬里蘭州，Bethesda（ NIH）。主題：基因疫苗和核酸疫苗戰(zhàn)略。 ? 1995年 4月 69日，美國(guó)弗吉尼亞州。主題： DNA疫苗：疫苗學(xué)的新時(shí)代。 ? 1996年 2月 58日，美國(guó)馬里蘭州 NIH Natcher會(huì)議中心。主題：核酸疫苗預(yù)防傳染性疾病和控制核酸疫苗。 定義 核酸疫苗 (nucleic acid vaccine),也稱(chēng)基因疫苗 (geic vaccine),是指一類(lèi)將抗原基因重組到表達(dá)載體上的重組質(zhì)粒疫苗，經(jīng) 肌肉注射 或黏膜免疫等方法導(dǎo)入宿主體內(nèi)，通過(guò)宿主細(xì)胞表達(dá)抗原蛋白，誘導(dǎo)宿主細(xì)胞產(chǎn)生對(duì)該抗原蛋白的免疫應(yīng)答，以達(dá)到預(yù)防和治療疾病的目的。 基因疫苗的構(gòu)建 基因疫苗構(gòu)建的基本途徑 基因疫苗的構(gòu)建 一、構(gòu)建基因疫苗的載體 載體是將抗原基因?qū)氲綑C(jī)體細(xì)胞的必要工具。 按照載體功能可分為克隆載體和表達(dá)載體； 按照載體來(lái)源可分為質(zhì)粒、噬菌體、黏粒和病毒載體等。 、 、 （ +/）、 pcDNA pcDNA4/HisMAX、 pBudCE pRc/RSV 、 pRc/CMV2等多種 基因疫苗的構(gòu)建 二、基因疫苗的構(gòu)建方法 獲得需要的目的基因常用的方法： （ 1）直接從生物體中提取總 DNA，構(gòu)建基因組 DNA文庫(kù) (genomic DNA library)，從中調(diào)用目的基因； （ 2）以 mRNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成互補(bǔ)的DNA片段，建立 cDNA文庫(kù)； （ 3）利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（ PCR）特異性地?cái)U(kuò)增所需要的目的基因片段，等等。 （ 4）化學(xué)合成 基因疫苗的構(gòu)建 基因表達(dá)載體的組成： 復(fù)制原點(diǎn) +啟動(dòng)子 +目的基因 +終止子 +標(biāo)記基因 為了保證抗原基因的定向正確插入，只有以正確的方向插入表達(dá)載體讀框啟動(dòng)子下游才能表達(dá)抗原基因，故抗原基因兩端應(yīng)具有不同的酶切位點(diǎn)，在設(shè)計(jì)時(shí)須注意這點(diǎn)。 連接的方式可分為 粘性末端連接 和 平末端連接 兩種，其中前者連接效率較高，使用比較多。連接反應(yīng)時(shí)應(yīng)考慮反應(yīng)體積、抗原基因與載體的比例、溫度和時(shí)間和酶量。 粘性末端連接 用同一種或兩種 限制性?xún)?nèi)切酶 酶切 DNA連接酶 重組質(zhì)粒 質(zhì)粒 目的基因 本法適用于在質(zhì)粒和目的基 因上有 相同 單或雙酶切位點(diǎn) 平末端連接 質(zhì)粒 產(chǎn)生 平末端 的 內(nèi)切酶 DNA連接酶 核酸酶 S1 目的基因 重組質(zhì)粒 本法適用于在質(zhì)粒 和目的基因上 沒(méi)有 相同 的酶切位點(diǎn)！ 基因疫苗的構(gòu)建 轉(zhuǎn)化：將質(zhì)粒或者以它為載體構(gòu)建的重組子導(dǎo)入 細(xì)菌 的過(guò)程。 轉(zhuǎn)染：將質(zhì)?；蛘咭运鼮檩d體構(gòu)建的重組子導(dǎo)入 真核細(xì)胞 的過(guò)程。 感受態(tài)：細(xì)菌經(jīng)過(guò) CaCl2溶液處理和短暫熱激后，容易攝入外源 DNA，這種狀態(tài)稱(chēng)為感受態(tài)。其原理是細(xì)菌處于 0℃ 、低滲CaCl2溶液中時(shí)，細(xì)胞壁和細(xì)胞膜通透性增加。此時(shí)轉(zhuǎn)化混合物中的 DNA形成抗 DNase的羥基 鈣磷酸復(fù)合物黏附于細(xì)胞表面，經(jīng)短暫的熱激（ 42 ℃ ）處理后，外源基因容易進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)。 常用的方法為氯化鈣共沉淀法和電穿孔法。 基因疫苗的構(gòu)建 一般重組質(zhì)粒鑒定主要按照表型篩選、酶切鑒定和測(cè)序鑒定的順序進(jìn)行 （ 1）插入片段鑒定：酶切鑒定； PCR鑒定。 （ 2）插入片段方向性鑒定：可利用聯(lián)合酶切方案進(jìn)行目的基因的插入方向鑒定。 （ 3） DNA序列測(cè)定：末端終止法測(cè)序；自動(dòng)測(cè)序儀測(cè)序 基因疫苗的構(gòu)建 三、重組質(zhì)粒在真核細(xì)胞中的表達(dá)與檢測(cè) 磷酸鈣共沉淀法、電穿孔法、脂質(zhì)體介導(dǎo)等方法都可以用來(lái)將外源質(zhì)粒導(dǎo)入真核細(xì)胞，其中脂質(zhì)體介導(dǎo)容易成功，是最常用的方法。 （ 1）蛋白水平的檢測(cè)：免疫沉淀法檢測(cè)表達(dá)蛋白； Western印跡檢測(cè)；酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定。 （ 2）核酸水平的檢測(cè)： RNA印跡； RTPCR檢測(cè)。 由于這個(gè)過(guò)程實(shí)際上是相當(dāng)復(fù)雜的，所以人們對(duì)一些具體的細(xì)節(jié)并不清楚。下面通過(guò)對(duì)基因疫苗經(jīng)過(guò)肌肉組織和黏膜免疫的抗原呈遞途徑來(lái)說(shuō)明基因疫苗的工作原理。 基因疫苗經(jīng)黏膜和皮膚
教學(xué)課件相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號(hào)-1