【正文】 胞包圍（致密或分散）。因此，需要進(jìn)一步研究來確定卵丘擴(kuò)展與卵母細(xì)胞成熟是否有關(guān)系 . 響 卵母細(xì)胞周圍的卵丘細(xì)胞層數(shù)是影響卵母細(xì)胞成熟的重要因素。卵丘擴(kuò)展對卵母細(xì)胞核成熟沒有明顯影響。但最近的報(bào)道對 =:過程中卵丘擴(kuò)展在支持胚胎發(fā)育上提出質(zhì)疑。孫興參等實(shí)驗(yàn)中卵丘擴(kuò)展良好或不好對卵母細(xì)胞核成熟沒有明顯的影響，得出豬卵丘細(xì)胞擴(kuò)展不依賴于卵母細(xì)胞 ［ 4］ 。一般絕大多數(shù)的 1級成熟卵和多數(shù)的 2,級成熟卵均已達(dá)到成熟狀態(tài)，排出第一極體 . 卵丘擴(kuò)展與卵母細(xì)胞成熟之間的關(guān)系很復(fù)雜。m）； ,級成熟卵為“卵丘細(xì)胞中等擴(kuò)展”，卵丘細(xì)胞向外擴(kuò)展約 ,倍于裸卵直徑（ 200181。卵丘細(xì)胞是否成熟是卵母細(xì)胞成熟的重要標(biāo)志，只有兩者均成熟時(shí)，精子才能有效地穿透卵子并進(jìn)而發(fā)生卵裂燕 山 大 學(xué) 課 程 設(shè) 計(jì) 說 明 書 9 ［ 10］ 。 卵丘擴(kuò)展對卵母細(xì)胞體外成熟的影響 在卵母細(xì)胞成熟過程中，卵丘細(xì)胞也隨之成 熟而充分?jǐn)U展，從而中斷了卵丘細(xì)胞之間以及卵丘細(xì)胞與卵母細(xì)胞之間的緊密連接狀態(tài)，進(jìn)而疏通了這些細(xì)胞之間營養(yǎng)物質(zhì)交換的通道。 ，添加卵丘細(xì)胞 ( 106個(gè)／ mL)可以促進(jìn)牛有完整放射冠的卵母細(xì)胞的發(fā)育，但在培養(yǎng)液中，添加與COCs中卵丘細(xì)胞濃度相同的卵丘細(xì)胞數(shù)（ 106個(gè)／ mL）對于裸卵的發(fā)育無作用， ～ 106個(gè)卵丘細(xì)胞／ mL對于帶有完整縫隙連接的卵母細(xì)胞的體外成熟效果最好。這可能是由于牛卵母細(xì)胞在體外大部分可自發(fā)恢復(fù)減數(shù)分裂并發(fā)育至成熟。卵丘細(xì)胞與卵母細(xì)胞間的作用機(jī)制先前認(rèn)為是一些生長因子如表皮生長因子（ EFG）、胰島素樣生長因（ IGF1）通過卵丘細(xì)胞對卵母細(xì)胞行使促成熟影響，但目前證明生長因子對牛和鼠的裸卵也有促成熟作用，卵母細(xì)胞也存在 IGF1受體 mRNA。體外成熟過程中卵丘細(xì)胞的構(gòu)成蛋白和新生蛋白都有明顯改變，如果在培養(yǎng)過程中去除卵丘細(xì)胞將明顯降 低牛卵母細(xì)胞成熟、受精和胚胎發(fā)育能力 ［ 3］ 。如果兩者間縫隙連接過早破壞，卵母細(xì)胞可能停止發(fā)育 ［ 2］ 。卵母細(xì)胞所需的營養(yǎng)物質(zhì)依賴卵丘細(xì)胞提供，兩者間通過縫隙連接進(jìn)行信號傳導(dǎo)，進(jìn)而調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞的生長和成熟。卵泡中的縫隙連接使壁層顆粒細(xì)胞、卵丘細(xì)胞和卵母細(xì)胞共同形成一個(gè)結(jié)構(gòu)和功能上的合胞體 [1]。到有腔卵泡時(shí)，卵泡細(xì)胞分為兩部分：一部分為壁層顆粒細(xì)胞，與基膜相連：另一部分為包圍卵母細(xì)胞的卵丘細(xì)胞。在這些卵泡細(xì)胞內(nèi)，線粒體和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富。原始卵泡由位于中心的卵母細(xì)胞和其周圍的一層扁平卵泡細(xì)胞組成。本文主要對卵丘細(xì)胞在卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)過程中的作用加以闡述，進(jìn)而對卵母細(xì)胞的體外成熟培養(yǎng)加以改進(jìn)。在排卵前，由于促性腺激素的作用， 卵母細(xì)胞完成減數(shù)分裂的同時(shí)，卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合物（ 4C4D）的卵丘發(fā)生擴(kuò)展， 4C4D在體外成熟培養(yǎng)過程中也發(fā)生類似的變化。 NGF 也是豬卵母細(xì)胞體外成熟過程中重要的調(diào)節(jié)物質(zhì)之一，能影響豬卵母細(xì)胞成熟的動(dòng)力學(xué)，加快進(jìn)入 M11 期。 Abeydeera 的研究表明， EGF 能提高卵母細(xì)胞成熟過程中蛋白質(zhì)的合成，從而提高卵母細(xì)胞胞質(zhì)的質(zhì)量， IGF 對細(xì)胞具有促分裂、分化及促代謝等生物學(xué)功能，是一個(gè)具有多種生理功能的生長因子，因此，同樣能促進(jìn)豬卵母細(xì)胞的成熟，并能提高所得胚胎的發(fā)育能力。 與卵母細(xì)胞體外成熟相關(guān)的細(xì)胞生長因子主要包括表皮生長因子(Epidermal growth factor， EGF)，胰島素樣生長因子 (insulinlike growth factors，IGF)、成纖維細(xì)胞生長因子 (Fibroblast Growth Factor， FGF)、轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor， TGF )及神經(jīng)生長因子 (nerve growth factor， NGF)等，這些細(xì)胞生長因子之間相互作用，對卵母細(xì)胞的成熟、受精與卵裂起著重要作用。Yashida 等報(bào)道在成熟培養(yǎng)基中添加豬卵泡液可顯著提高豬卵母細(xì)胞的核成熟率、正常受精率及卵裂率。 豬卵泡液 (pig follicular fluid， pFF)是豬卵母細(xì)胞發(fā)育的微環(huán)境，對卵母細(xì)胞的成熟有著重要的調(diào)節(jié)作用，主要表現(xiàn)在提高豬卵母細(xì)胞成熟的質(zhì)量并增加胚胎的發(fā)育能力。此外血清的來源不同、批次不同均會(huì)導(dǎo)致血清中所含組分及組分間比例不同，從而導(dǎo)致了卵母細(xì)胞體外成熟、體外受精和體外培養(yǎng)的不穩(wěn)定。近年來，許多研究者又在豬的卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)液中添加一定比例的豬血清，其中包括 :新生仔豬血清，母豬發(fā)情的血清等。在豬卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)中，用得最廣泛的是在成燕 山 大 學(xué) 課 程 設(shè) 計(jì) 說 明 書 6 熟培養(yǎng)液中添加 10%的胎牛血清（ Fetal bovine serum， FBS）。蔡令波等在培養(yǎng)后期去除促性腺激素也得出了相似結(jié)果。但彭禮繁等卻認(rèn)為 LH 對豬卵母細(xì)胞體外成熟的促進(jìn)效果要強(qiáng)于 FSH。在豬卵 母細(xì)胞體外成熟研究中，許多學(xué)者都選擇添加 PMSG,有人還認(rèn)為添加 PMSG 和 hCG 的組合對豬卵母細(xì)胞核成熟的促進(jìn)作用優(yōu)于添加 FSH 和 LH。但葉華虎等研究發(fā)現(xiàn)，受精后胚胎發(fā)育能力 NCSU23占明顯優(yōu)勢。s 液中 Lalantha等人認(rèn)為在不添加蛋白質(zhì)添加物的情況下 TCM199 更有利于卵母細(xì)胞的核成熟，而在Waymouth基礎(chǔ)液中成熟的卵母細(xì)胞其核成熟率雄原核形成率和囊胚發(fā)育率較低。成熟燕 山 大 學(xué) 課 程 設(shè) 計(jì) 說 明 書 5 培養(yǎng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)液不同卵母細(xì)胞成熟后 GSH 的含量存在顯著差異， IVF后雄原核形成率也不同。s medium， NCSU23， TCM199NCSU37。 成熟基礎(chǔ)液的構(gòu)成 ,直接影響到卵母細(xì)胞的成熟率及以后的受精和胚胎發(fā)育。相對于普通的單皿培養(yǎng)法而言，微滴培養(yǎng)法和套皿培養(yǎng)法可以更好的保持細(xì)胞發(fā)育所需要的微環(huán)境，同時(shí)減少微生物的污染。 Sosnowki 等研究發(fā)現(xiàn)培養(yǎng) 40~48 h 與 30~36 h 對豬卵母細(xì)胞體外成熟率差異顯著，但是分析染色體核型發(fā)現(xiàn)，隨著體外培養(yǎng)時(shí)間的延長，染色體異常率會(huì)隨之增加。另外，要保證所用氣體的無毒。在這兩種氣相中， CO2 的含量很關(guān)鍵。此外，培養(yǎng)箱所用的水的純度和高度無菌也是培養(yǎng)成功的關(guān)鍵性因素。 濕度 在 IVM 時(shí)一般采用的是飽和濕度，目的是減少培養(yǎng)基內(nèi)的水分蒸發(fā)，從而維持培養(yǎng)基中卵母細(xì)胞所需要的各種物質(zhì)的濃度及保持滲透壓。 目前，常用的采集豬卵母細(xì)胞的方法有三種即抽吸法、切割法和刺破法，相對于刺破法和切割法而言，抽吸法較為常用，但是所獲得的卵母細(xì)胞質(zhì)量較差，甚至出現(xiàn)較多的裸卵，進(jìn)而間接地影響了體外培養(yǎng)的效果。 C 級：裸卵或卵丘細(xì)胞雖為 1~2 層或多層，但是不完整，部分裸露。 A 級 ： 卵丘細(xì)胞在 3 層或 3層以上。排卵之前，卵丘細(xì)胞擴(kuò)展，合成大量胞外基質(zhì)，并富含透明質(zhì)酸（ Hyaluronic： HA），有利于排卵后進(jìn)入輸卵管，同時(shí)保證了卵母細(xì)胞正常的受精和胚胎發(fā)育潛力，所以，卵丘細(xì)胞的擴(kuò)張對卵母細(xì)胞成熟，特別是卵母細(xì)胞胞質(zhì)成熟起著重要作用。但在特別大的卵泡中有些卵母細(xì)胞有嚴(yán)重退化的現(xiàn)象。 Yoon等研究發(fā)現(xiàn)來自3~8mm直徑卵泡 的卵母細(xì)胞成熟率顯著高于小于 3mm的卵泡卵母細(xì)胞 (91%vs 58%)。相對于其他哺乳動(dòng)物而言，豬卵母細(xì)胞對溫度的敏感度較高，較高或較低都會(huì)直接影響到體外成熟的效果，一般來講，豬卵巢的保存溫度在 28~35℃ ，文國藝等研究表明，當(dāng)卵巢的保存溫度低于 25℃ ，豬卵母細(xì)胞體外成熟收到明顯的影響并進(jìn)而影響到受精的結(jié)果 。 一般而言，卵巢離體的時(shí)間要求在 2~4h 內(nèi)，時(shí)間越短，所獲得的卵母細(xì)胞的質(zhì)量 越好，體外成熟培養(yǎng)的效果也越好。彭輝等研究表明，在牛卵母細(xì)胞的體外成熟培養(yǎng)中，有著同樣的燕 山 大 學(xué) 課 程 設(shè) 計(jì) 說 明 書 3 結(jié)果，即卵泡期卵母細(xì)胞的體外成熟培養(yǎng)結(jié)果要高于黃體期 [xxvi]。無黃體期卵巢上的卵母細(xì)胞比黃體期卵巢上卵母細(xì)胞成熟效果要好。反之，取自仔豬、處女豬、老母豬及老弱病殘豬的卵母細(xì)胞的體外成熟培養(yǎng)效果則較差。 不同的國家和地區(qū)之間，豬的品種必定存在著遺傳因素、飼養(yǎng)環(huán)境和氣候條件等等的因素而帶來品質(zhì)上的差異，從而影響豬卵母細(xì)胞的質(zhì)量進(jìn)而對體外成熟培養(yǎng)也產(chǎn)生一定的影響。 2. 影響豬卵母細(xì)胞體外成熟的因素 卵巢來源豬的年齡、品種及健康狀況 同一種動(dòng)物在不同年齡段其卵母細(xì)胞在體外成熟的情況也有所不同。透明帶是一層糖蛋白膜，受精時(shí)可以結(jié)合并誘導(dǎo)精子發(fā)生頂體反應(yīng)，并阻止多精受精。燕 山 大 學(xué) 課 程 設(shè) 計(jì) 說 明 書 2 有些細(xì)胞質(zhì)成熟過程依賴于細(xì)胞核成熟。隨著卵母細(xì)胞的成熟，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)減少，而滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)增多，到成熟晚期，滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)變得很少。高爾基復(fù)合體最初位于核的周圍，成熟過程中移向皮質(zhì)，皮質(zhì)顆粒完全形成后，高爾復(fù)合體在皮質(zhì)中消失。 細(xì)胞核成熟即卵母細(xì)胞恢復(fù)減數(shù)分裂，發(fā)生生發(fā)泡破裂 (genninal vesiclebreakdown， GVBD)并發(fā)育到第一次減數(shù)分裂中期；與此同時(shí)，卵母細(xì)胞進(jìn)一步跨越第一次減數(shù)分裂中期，排出第一極體 (第一極體含有極微量的細(xì)胞質(zhì)，不久就退化 )并停止于第二次減數(shù)分裂的中期，直到受精 (或激活 )后才