【正文】 方法主要由于操作程序復(fù)雜，成本較 高或者因受動(dòng)物機(jī)體發(fā)育季節(jié)的影響 而在國內(nèi)較少使用。在家畜采卵一般經(jīng)過體外成熟才能 受精。此法多用于 小鼠，家兔，山羊，綿羊等小型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。 卵母細(xì)胞的準(zhǔn)備 卵母細(xì)胞的準(zhǔn)備：一般情況下，卵母細(xì)胞的獲取主要有三種方法。 8 細(xì)胞因子對(duì)牛體外受精胚胎細(xì)胞凋亡的影響 2 實(shí)驗(yàn)研究 實(shí)驗(yàn)方法 口吸撿卵針的準(zhǔn)備 將玻璃細(xì)管在酒精燈上均勻 的加熱滅菌，然后在細(xì)管的中間位置或者一邊上集 中加熱，等玻璃管明顯變軟的時(shí)候根據(jù)手感迅速向兩側(cè)拉直，斷開，并在酒精燈上 烤平針尖和針尾。有些研究顯示， CYS 對(duì)卵母細(xì) 胞的成熟沒有影響但能夠促進(jìn)囊胚率和孵化囊胚率。半胱胺（ CYS）是一種含有硫醇成分的谷胱甘肽（ GSH） 前體，能夠在卵丘 卵母細(xì)胞復(fù)合 體（ COCs）內(nèi)合成 GSH 并提高其含量。 Arellano 等的研究結(jié)果表明， EGF 能顯著提高豬卵母細(xì)胞的體外成熟率。在各 種生長因子中， EGF 在卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)中應(yīng)用較 多， EGF 是顆粒細(xì)胞強(qiáng)有力的分裂素，也可能是卵母細(xì)胞成熟分裂恢復(fù)的一種信號(hào) 因子。 Coskun 和 Erickson 等的研究表明，表皮生長因子（ EGF）、胰島素樣生長因子 （ IGF）、轉(zhuǎn)移生長因子 (TGF)等生長因子都能不同程度地促進(jìn)小鼠、大鼠、牛、豬、 倉鼠等卵母細(xì)胞的體外成熟。采取有效檢測方法確定卵母細(xì)胞和胚胎的凋亡機(jī)制，對(duì)提高體外授精的囊 胚率有重要意義。 胚胎細(xì)胞凋亡研究展望 在哺乳動(dòng)物中，雌性生殖細(xì)胞的存活與凋亡調(diào)控是多因子參與的復(fù)雜調(diào)節(jié)過程。目前對(duì)凋亡 細(xì)胞的檢測常規(guī)采用形態(tài)學(xué)檢查和 DNA 電泳分析，更靈敏的方法可采用流式細(xì)胞儀 檢測法、 TUNEL 及 ELISA 法等。但在細(xì)胞凋亡的晚期和死亡細(xì)胞， Caspase3 的活性明顯下降。 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文 7 Caspase3 活性的檢測 Caspase 家族在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過程中起著非常重要的作用，其中 Caspase3 是關(guān)鍵的執(zhí)行分子，它在凋亡信號(hào)傳導(dǎo)的許多途徑中發(fā)揮功能。 線粒體膜勢能的檢測 線粒體在細(xì)胞凋亡的過程中起著樞紐作用，多種細(xì)胞凋亡刺激因子均可誘導(dǎo)不 同的細(xì)胞發(fā)生凋亡，而線粒體跨膜電位 DYmt 的下降，被 認(rèn)為是細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)過 程中最早發(fā)生的事件，它發(fā)生在細(xì)胞核凋亡特征（染色質(zhì)濃縮、 DNA 斷裂）出現(xiàn)之 前，一旦線粒體 DYmt 崩潰，則細(xì)胞凋亡不可逆轉(zhuǎn)?？啥繙y 定細(xì)胞凋亡，無需預(yù)先標(biāo)記細(xì)胞，所用抗體不具有種屬特異性， POD 標(biāo)記的抗 DNA 抗體可與單鏈和雙鏈的 DNA 起反應(yīng)。通過酶標(biāo)測定儀分析，即可定量反映細(xì)胞凋亡 的水平。而核小體 DNA 與中心組蛋白 H2A， H2B， H3 和 H4 緊密結(jié)合，又可以防止核酸內(nèi)切酶的切割作用，故產(chǎn)生的 DNA 片段是 180～ 200 bp 的整數(shù)倍，并在凋亡細(xì)胞的胞漿中出現(xiàn)核小體或寡聚核小體。此外，將 PCR 技術(shù)和核酸分子雜交技術(shù)相結(jié)合，能顯著提高檢測的特異性和靈 敏度。又如 RTPCR 被用 來檢測 Bcl2 和 Bax 基因表達(dá)水平的比例，根據(jù)其比例分析細(xì)胞是存活還是凋亡。 如 LMPCR 被用來擴(kuò)增凋亡細(xì)胞產(chǎn)生的 DNA 片段。 6 細(xì)胞因子對(duì)牛體外受精胚胎細(xì)胞凋亡的影響 PCR 技術(shù)檢測 在細(xì)胞凋亡的機(jī)理研究中，發(fā)現(xiàn)了很多表達(dá)異常的基因，檢測這些特異基因的 表達(dá)水平也是檢測細(xì)胞凋亡的一種方法。而壞死細(xì)胞 DNA 電泳后則呈模糊的 涂片狀。經(jīng) 這些內(nèi)切酶切割使核小體間斷裂，產(chǎn)生大小不同的片段，但都是 180～ 200 bp 的整 數(shù) 15 倍。原位 TUNEL 法快速， 其反應(yīng)全過程僅需約 3 h，其靈敏度及特異性都較高，尤其適用于作有關(guān)細(xì)胞凋亡 與相關(guān)基因表達(dá)關(guān)系方面的研究。該方法可用細(xì)胞懸液、細(xì)胞涂片、載玻片上的粘連細(xì) 胞、冰凍組織或石蠟包埋組織為 檢測標(biāo)本，可在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶 (TdT) 的作用下，將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸酶或生物素形成的 衍生物標(biāo)記到 DNA 的 339。OH 末端，而正常的或正在增殖的細(xì)胞幾乎沒有 DNA 的 斷裂，因而沒有 339。 TUNEL 法 該 方 法 稱 為 脫 氧 核 糖 核 苷 酸 末 端 轉(zhuǎn) 移 酶 介 導(dǎo) 的 缺 口 末 端 標(biāo) 記 法 (terminaldeoxynucleotidyl transferase mediated niek end labeling， TUNEL)， 1992 年 Gavrieli 等首先報(bào)道了該方法。碘 化丙啶（ Propidine iodide,PI）是一種核酸染料，它不能透過完整的細(xì)胞膜，但在 凋亡中晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞， PI 能夠透細(xì)胞膜而使細(xì)胞核紅染。 AnnexinV 是一種分子量為 35～ 36 KD 的 Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋 白，能與 PS 高親和 力特異性結(jié)合。以下介紹幾種常用生化檢測方 法。目前一般都通過生化檢測方法來判斷。一般認(rèn)為，凋亡小 體幾分鐘即可形成，被吞噬的凋亡小體可在細(xì)胞內(nèi)存留數(shù)小時(shí) [28]。這種死亡過程不發(fā)生溶酶體、線粒體及細(xì)胞膜破裂，沒 有細(xì)胞內(nèi)涵物外泄， 故不引起炎癥反應(yīng)。 細(xì)胞凋亡檢測方法 形態(tài)學(xué)檢測 形態(tài)學(xué)檢測是依據(jù)細(xì)胞凋亡過程中所表現(xiàn)出來的一些形態(tài)學(xué)特征來判定凋亡。如在小鼠， 2細(xì)胞階段以后；在人和豬， 48 細(xì)胞階段以后；在牛， 816 細(xì)胞階段以后 ,而且體內(nèi)發(fā)育 條件下細(xì)胞凋亡是 EGA 之后發(fā)生的。動(dòng)物受精后 胚胎基因組并不是立即轉(zhuǎn)錄表達(dá)的，而是先表達(dá)母源基因組，再表達(dá)胚胎基因組。 胚胎的細(xì)胞凋亡 根據(jù)研究，體外培養(yǎng)的胚胎與體內(nèi)培養(yǎng)的胚胎相比，細(xì)胞發(fā)生凋亡的時(shí)間更早， 且凋亡數(shù)量更多。在死亡的卵母細(xì)胞， BCL2L10 與促凋亡 BAX 共定位，并且中和 BCL2L10 會(huì)加速卵母細(xì)胞死亡。研究揭露出從卵子傳 遞到合子的一種進(jìn)化上保守的途徑?？沟蛲鲱? Bcl2 蛋白可以通過阻止促凋亡蛋白在線粒體膜上形成低聚體來發(fā)揮其抗凋亡作用 [26]。 Bax 和 Bak 需要結(jié)合到 VDAC 并使其形成一個(gè)巨大通道才能釋放細(xì)胞色素 C。脂質(zhì)體的研究中顯示 ， Bclxl 能 4 細(xì)胞因子對(duì)牛體外受精胚胎細(xì)胞凋亡的影響 刺激 VDAC 的關(guān)閉，而 Bax 和 Bak 能促進(jìn)其開啟，這可能使細(xì)胞色素 C 的通過。 Antonsson 發(fā)現(xiàn) [25]， 抗凋亡和促凋亡多結(jié)構(gòu)域蛋白相互作用 ， 在體外人工脂質(zhì) 體膜上可形成通道。 此外 ， 當(dāng)?shù)蛲霭l(fā)生時(shí) BH3 單結(jié)構(gòu)域蛋白 Bim 水平提高 ， 而 Mcl1 和 Bik 水平保持不 變。除了 BH3 特有結(jié)構(gòu)域促凋亡成員外其他成員間的相互作用的意義還沒有 確定。當(dāng)大部分 成員間隨意作用時(shí) ， 死亡促進(jìn)因子和死亡抑制因子間的有些相互作用是可能高度專 一的 （ 比如 Bok 與 Mcl1 間 ） 。其中抗凋亡成員包括 （ Bcl2, BclXl, Bclw, AL, Mcl1, DIVA/BOO, NR13） ,促凋亡成員包括 （ Bax, BclXs,Bclrambo, Bak, Bad, Bok, Bik, Bid, Bim/Bod, Bik/Nbk, Hrk, Bmf, Nix, PUMA, Noxa, BNip3） 等。 細(xì)胞凋亡相關(guān)基因 近年來 , Bcl2 基因蛋白家族作用機(jī)制方面進(jìn)行了大量研究 ,對(duì)其已有了一定的 了解 ,并提出了幾種作用模式 ,但確切的機(jī)制尚未確定。在很多中途發(fā)生閉鎖的卵泡中 ， 卵母細(xì)胞中 tPA 活性很高 ， 而健康卵泡的卵母細(xì)胞則 tPA 活性很低。在這種類型 的閉鎖中 ， 可 觀察到顆粒細(xì)胞的 DNA 電泳呈典型的凋亡形狀分布。比如 ， 促性腺激素可誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡抑制 蛋白 (NAIP)的表達(dá) ， NAIP 在發(fā)育卵泡的顆粒細(xì)胞中均有表達(dá) ， 而在那些預(yù)定要凋亡 的卵泡的顆粒細(xì)胞中卻沒有表達(dá)或表達(dá)很弱。胚胎時(shí)期生殖細(xì)胞的大量丟失與 成體中發(fā)生的卵泡閉鎖雖然本質(zhì)上都是細(xì)胞凋亡 ， 但它們遵循 的卻是不同的調(diào)控機(jī) 制。免疫化學(xué)試驗(yàn)表明 ， 凋亡開始之前 ， 暴露于 PAHs 的胚胎卵 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文 3 巢生殖細(xì)胞中有 Bcl2 家族促凋亡成員 Bax 蛋白的聚集 ； 相反 ， 與 ANF 共培養(yǎng)則會(huì) 抑制 Bax 蛋白的表達(dá)。此外 ， AHR 對(duì) 于多環(huán)芳香烴 [PAHs] （ 一類在環(huán)境如香煙中廣泛存在 ， 已知會(huì)引起胚胎期雌性生 殖細(xì)胞死亡的化學(xué)物質(zhì) ） 也是一種很好的受體。近來一項(xiàng)新的研究發(fā)現(xiàn) , 有一種叫芳香烴受體 (AHR)的胞質(zhì)受體 ,其基因突變可減輕小鼠胚胎的卵母細(xì)胞凋亡 , 這樣的小鼠在出生時(shí) ,其體內(nèi)原始卵泡的數(shù)量是正常小鼠的兩倍。二是激活的 caspase8 將引起 Bcl2 家族中促凋亡成員 Bid 的裂解 , 從而破壞線粒體 ,使其釋放包括細(xì)胞色素 C 在內(nèi)的多種凋亡發(fā)生因子 ,促進(jìn)凋亡體 (包含有 Apaf1 和 caspase9 酶原 )的形成 ,最終引發(fā)凋亡 [16,17]， 此途徑也成為線粒 體途徑。敲除這些基因就會(huì)改變原始卵泡的儲(chǔ)備量 。 卵母細(xì)胞凋亡分子機(jī)理 在胚胎性腺中存在著死亡信號(hào) (TNFα、 Fas 配體等 )和存活信號(hào) (LIF、 kit 配體 等 )。包囊在卵泡形成時(shí)破裂 ， 那些行使滋養(yǎng)功能的附屬生殖 細(xì)胞全部 “自 我犧牲 ”， 而這一時(shí)期也是胚胎生殖細(xì)胞大量丟失的時(shí)期。因缺陷死亡理 論認(rèn)為 ， 凋亡能除去減數(shù)分裂時(shí)發(fā)生配對(duì)錯(cuò)誤或重組異常的卵母細(xì)胞 ， 即體內(nèi)存在 一個(gè)監(jiān)控機(jī)制 ， 可發(fā)現(xiàn)并除去有缺陷的卵母細(xì)胞 ， 而保留能正常進(jìn)行減數(shù)分裂的卵 母細(xì)胞來形成原始卵泡 。被忽視死 亡 ， 是指因不能從環(huán)境中得到足夠 的存活因子而導(dǎo)致的細(xì)胞死亡。因缺陷死亡 (death by defect)。 卵母細(xì)胞凋亡假說 為什么會(huì)有如此巨大比例的雌性生殖細(xì)胞發(fā)生凋亡 ？ 人們目前提出了三種學(xué)說 來解釋。 De Pol[10] 等采用原位末端標(biāo)記技術(shù) (TUNEL)，觀察到了懷孕 1820 周的人類胚胎卵巢內(nèi)典型的 2 細(xì)胞因子對(duì)牛體外受精胚胎細(xì) 胞凋亡的影響 凋亡細(xì)胞形態(tài) ， 并且還證實(shí) ， 這個(gè)時(shí)期的胚胎中只有生殖細(xì)胞發(fā)生了凋亡 ， 發(fā) 生凋亡的生殖細(xì)胞比率約為 8%。而在其它哺乳動(dòng)物中，同等比例的生殖細(xì)胞也會(huì) 在卵子發(fā)生的過程中退化閉鎖。在人類中，妊娠 8 周的女性胚胎卵 原細(xì)胞就開始增殖，在第 20 周左右達(dá)到峰值，由 1000 個(gè)左右迅速分裂達(dá)到約 700 萬個(gè)。 在胚胎發(fā)育階段，雌性動(dòng)物卵巢內(nèi)的卵原細(xì)胞 (oogonia)，持續(xù)進(jìn)行活躍的有絲分裂， 不斷增殖，最后形成初級(jí)卵母細(xì)胞，靜止在第一次減數(shù)分裂的雙線期 [5]。在許多無脊椎動(dòng)物和脊 椎動(dòng)物中，大量的生殖細(xì)胞在發(fā)育的不同階段丟失 [1,2]。本文通過牛體外受精胚胎培養(yǎng)體系中添加不同細(xì)胞因子，在細(xì)胞層面上 研究其對(duì)胚胎早期發(fā)育各個(gè)階段細(xì)胞凋亡的影響，對(duì)體外受精技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化提供更 多的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制調(diào)控方面國內(nèi)外在體細(xì)胞上取得了很多重大成就。前者是從形態(tài)學(xué)角度提出的概念，而后者是從發(fā)育學(xué)角度提 出的概念。這三位科 學(xué)家因秀麗新桿線蟲模式中細(xì)胞凋亡的卓越成就而分享了 2022 年諾貝爾生理或醫(yī) 學(xué)獎(jiǎng)。同年 Brenner 將細(xì)胞凋亡跟基 因調(diào)控聯(lián)系了起來。細(xì)胞凋亡能表現(xiàn)出一些典型的形態(tài)和生化 特征，在附植前胚胎細(xì)胞凋亡評(píng)定中也廣泛應(yīng)用了這些特征。 Reproduction） 目 錄 1 引言 ................................................................ 1 卵母細(xì)胞凋亡現(xiàn)象 ................................................ 1 卵母細(xì)胞凋亡假說 ................................................ 2 卵母細(xì)胞凋亡分子機(jī)理 ............................................ 2 細(xì)胞凋亡相關(guān)基因 ................................................ 3 胚胎的細(xì)胞凋亡 .................................................. 4 細(xì)胞凋亡檢測方法 ................................................ 4 形態(tài)學(xué)檢測 ..............