【正文】 方法主要由于操作程序復(fù)雜，成本較 高或者因受動物機體發(fā)育季節(jié)的影響 而在國內(nèi)較少使用。在家畜采卵一般經(jīng)過體外成熟才能 受精。此法多用于 小鼠，家兔，山羊，綿羊等小型實驗動物。 卵母細(xì)胞的準(zhǔn)備 卵母細(xì)胞的準(zhǔn)備：一般情況下，卵母細(xì)胞的獲取主要有三種方法。 8 細(xì)胞因子對牛體外受精胚胎細(xì)胞凋亡的影響 2 實驗研究 實驗方法 口吸撿卵針的準(zhǔn)備 將玻璃細(xì)管在酒精燈上均勻 的加熱滅菌，然后在細(xì)管的中間位置或者一邊上集 中加熱，等玻璃管明顯變軟的時候根據(jù)手感迅速向兩側(cè)拉直，斷開，并在酒精燈上 烤平針尖和針尾。有些研究顯示， CYS 對卵母細(xì) 胞的成熟沒有影響但能夠促進囊胚率和孵化囊胚率。半胱胺（ CYS）是一種含有硫醇成分的谷胱甘肽（ GSH） 前體，能夠在卵丘 卵母細(xì)胞復(fù)合 體（ COCs）內(nèi)合成 GSH 并提高其含量。 Arellano 等的研究結(jié)果表明， EGF 能顯著提高豬卵母細(xì)胞的體外成熟率。在各 種生長因子中， EGF 在卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)中應(yīng)用較 多， EGF 是顆粒細(xì)胞強有力的分裂素，也可能是卵母細(xì)胞成熟分裂恢復(fù)的一種信號 因子。 Coskun 和 Erickson 等的研究表明，表皮生長因子（ EGF）、胰島素樣生長因子 （ IGF）、轉(zhuǎn)移生長因子 (TGF)等生長因子都能不同程度地促進小鼠、大鼠、牛、豬、 倉鼠等卵母細(xì)胞的體外成熟。采取有效檢測方法確定卵母細(xì)胞和胚胎的凋亡機制，對提高體外授精的囊 胚率有重要意義。 胚胎細(xì)胞凋亡研究展望 在哺乳動物中，雌性生殖細(xì)胞的存活與凋亡調(diào)控是多因子參與的復(fù)雜調(diào)節(jié)過程。目前對凋亡 細(xì)胞的檢測常規(guī)采用形態(tài)學(xué)檢查和 DNA 電泳分析，更靈敏的方法可采用流式細(xì)胞儀 檢測法、 TUNEL 及 ELISA 法等。但在細(xì)胞凋亡的晚期和死亡細(xì)胞， Caspase3 的活性明顯下降。 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文 7 Caspase3 活性的檢測 Caspase 家族在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過程中起著非常重要的作用，其中 Caspase3 是關(guān)鍵的執(zhí)行分子，它在凋亡信號傳導(dǎo)的許多途徑中發(fā)揮功能。 線粒體膜勢能的檢測 線粒體在細(xì)胞凋亡的過程中起著樞紐作用，多種細(xì)胞凋亡刺激因子均可誘導(dǎo)不 同的細(xì)胞發(fā)生凋亡，而線粒體跨膜電位 DYmt 的下降，被 認(rèn)為是細(xì)胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)過 程中最早發(fā)生的事件，它發(fā)生在細(xì)胞核凋亡特征（染色質(zhì)濃縮、 DNA 斷裂）出現(xiàn)之 前，一旦線粒體 DYmt 崩潰，則細(xì)胞凋亡不可逆轉(zhuǎn)。可定量測 定細(xì)胞凋亡，無需預(yù)先標(biāo)記細(xì)胞，所用抗體不具有種屬特異性， POD 標(biāo)記的抗 DNA 抗體可與單鏈和雙鏈的 DNA 起反應(yīng)。通過酶標(biāo)測定儀分析，即可定量反映細(xì)胞凋亡 的水平。而核小體 DNA 與中心組蛋白 H2A， H2B， H3 和 H4 緊密結(jié)合，又可以防止核酸內(nèi)切酶的切割作用，故產(chǎn)生的 DNA 片段是 180～ 200 bp 的整數(shù)倍，并在凋亡細(xì)胞的胞漿中出現(xiàn)核小體或寡聚核小體。此外，將 PCR 技術(shù)和核酸分子雜交技術(shù)相結(jié)合，能顯著提高檢測的特異性和靈 敏度。又如 RTPCR 被用 來檢測 Bcl2 和 Bax 基因表達水平的比例，根據(jù)其比例分析細(xì)胞是存活還是凋亡。 如 LMPCR 被用來擴增凋亡細(xì)胞產(chǎn)生的 DNA 片段。 6 細(xì)胞因子對牛體外受精胚胎細(xì)胞凋亡的影響 PCR 技術(shù)檢測 在細(xì)胞凋亡的機理研究中，發(fā)現(xiàn)了很多表達異常的基因，檢測這些特異基因的 表達水平也是檢測細(xì)胞凋亡的一種方法。而壞死細(xì)胞 DNA 電泳后則呈模糊的 涂片狀。經(jīng) 這些內(nèi)切酶切割使核小體間斷裂，產(chǎn)生大小不同的片段，但都是 180～ 200 bp 的整 數(shù) 15 倍。原位 TUNEL 法快速， 其反應(yīng)全過程僅需約 3 h，其靈敏度及特異性都較高，尤其適用于作有關(guān)細(xì)胞凋亡 與相關(guān)基因表達關(guān)系方面的研究。該方法可用細(xì)胞懸液、細(xì)胞涂片、載玻片上的粘連細(xì) 胞、冰凍組織或石蠟包埋組織為 檢測標(biāo)本，可在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶 (TdT) 的作用下，將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸酶或生物素形成的 衍生物標(biāo)記到 DNA 的 339。OH 末端，而正常的或正在增殖的細(xì)胞幾乎沒有 DNA 的 斷裂，因而沒有 339。 TUNEL 法 該 方 法 稱 為 脫 氧 核 糖 核 苷 酸 末 端 轉(zhuǎn) 移 酶 介 導(dǎo) 的 缺 口 末 端 標(biāo) 記 法 (terminaldeoxynucleotidyl transferase mediated niek end labeling， TUNEL)， 1992 年 Gavrieli 等首先報道了該方法。碘 化丙啶（ Propidine iodide,PI）是一種核酸染料，它不能透過完整的細(xì)胞膜，但在 凋亡中晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞， PI 能夠透細(xì)胞膜而使細(xì)胞核紅染。 AnnexinV 是一種分子量為 35～ 36 KD 的 Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋 白，能與 PS 高親和 力特異性結(jié)合。以下介紹幾種常用生化檢測方 法。目前一般都通過生化檢測方法來判斷。一般認(rèn)為，凋亡小 體幾分鐘即可形成，被吞噬的凋亡小體可在細(xì)胞內(nèi)存留數(shù)小時 [28]。這種死亡過程不發(fā)生溶酶體、線粒體及細(xì)胞膜破裂，沒 有細(xì)胞內(nèi)涵物外泄， 故不引起炎癥反應(yīng)。 細(xì)胞凋亡檢測方法 形態(tài)學(xué)檢測 形態(tài)學(xué)檢測是依據(jù)細(xì)胞凋亡過程中所表現(xiàn)出來的一些形態(tài)學(xué)特征來判定凋亡。如在小鼠， 2細(xì)胞階段以后；在人和豬， 48 細(xì)胞階段以后；在牛， 816 細(xì)胞階段以后 ,而且體內(nèi)發(fā)育 條件下細(xì)胞凋亡是 EGA 之后發(fā)生的。動物受精后 胚胎基因組并不是立即轉(zhuǎn)錄表達的，而是先表達母源基因組，再表達胚胎基因組。 胚胎的細(xì)胞凋亡 根據(jù)研究，體外培養(yǎng)的胚胎與體內(nèi)培養(yǎng)的胚胎相比，細(xì)胞發(fā)生凋亡的時間更早， 且凋亡數(shù)量更多。在死亡的卵母細(xì)胞， BCL2L10 與促凋亡 BAX 共定位，并且中和 BCL2L10 會加速卵母細(xì)胞死亡。研究揭露出從卵子傳 遞到合子的一種進化上保守的途徑?？沟蛲鲱? Bcl2 蛋白可以通過阻止促凋亡蛋白在線粒體膜上形成低聚體來發(fā)揮其抗凋亡作用 [26]。 Bax 和 Bak 需要結(jié)合到 VDAC 并使其形成一個巨大通道才能釋放細(xì)胞色素 C。脂質(zhì)體的研究中顯示 ， Bclxl 能 4 細(xì)胞因子對牛體外受精胚胎細(xì)胞凋亡的影響 刺激 VDAC 的關(guān)閉，而 Bax 和 Bak 能促進其開啟，這可能使細(xì)胞色素 C 的通過。 Antonsson 發(fā)現(xiàn) [25]， 抗凋亡和促凋亡多結(jié)構(gòu)域蛋白相互作用 ， 在體外人工脂質(zhì) 體膜上可形成通道。 此外 ， 當(dāng)?shù)蛲霭l(fā)生時 BH3 單結(jié)構(gòu)域蛋白 Bim 水平提高 ， 而 Mcl1 和 Bik 水平保持不 變。除了 BH3 特有結(jié)構(gòu)域促凋亡成員外其他成員間的相互作用的意義還沒有 確定。當(dāng)大部分 成員間隨意作用時 ， 死亡促進因子和死亡抑制因子間的有些相互作用是可能高度專 一的 （ 比如 Bok 與 Mcl1 間 ） 。其中抗凋亡成員包括 （ Bcl2, BclXl, Bclw, AL, Mcl1, DIVA/BOO, NR13） ,促凋亡成員包括 （ Bax, BclXs,Bclrambo, Bak, Bad, Bok, Bik, Bid, Bim/Bod, Bik/Nbk, Hrk, Bmf, Nix, PUMA, Noxa, BNip3） 等。 細(xì)胞凋亡相關(guān)基因 近年來 , Bcl2 基因蛋白家族作用機制方面進行了大量研究 ,對其已有了一定的 了解 ,并提出了幾種作用模式 ,但確切的機制尚未確定。在很多中途發(fā)生閉鎖的卵泡中 ， 卵母細(xì)胞中 tPA 活性很高 ， 而健康卵泡的卵母細(xì)胞則 tPA 活性很低。在這種類型 的閉鎖中 ， 可 觀察到顆粒細(xì)胞的 DNA 電泳呈典型的凋亡形狀分布。比如 ， 促性腺激素可誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡抑制 蛋白 (NAIP)的表達 ， NAIP 在發(fā)育卵泡的顆粒細(xì)胞中均有表達 ， 而在那些預(yù)定要凋亡 的卵泡的顆粒細(xì)胞中卻沒有表達或表達很弱。胚胎時期生殖細(xì)胞的大量丟失與 成體中發(fā)生的卵泡閉鎖雖然本質(zhì)上都是細(xì)胞凋亡 ， 但它們遵循 的卻是不同的調(diào)控機 制。免疫化學(xué)試驗表明 ， 凋亡開始之前 ， 暴露于 PAHs 的胚胎卵 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文 3 巢生殖細(xì)胞中有 Bcl2 家族促凋亡成員 Bax 蛋白的聚集 ； 相反 ， 與 ANF 共培養(yǎng)則會 抑制 Bax 蛋白的表達。此外 ， AHR 對 于多環(huán)芳香烴 [PAHs] （ 一類在環(huán)境如香煙中廣泛存在 ， 已知會引起胚胎期雌性生 殖細(xì)胞死亡的化學(xué)物質(zhì) ） 也是一種很好的受體。近來一項新的研究發(fā)現(xiàn) , 有一種叫芳香烴受體 (AHR)的胞質(zhì)受體 ,其基因突變可減輕小鼠胚胎的卵母細(xì)胞凋亡 , 這樣的小鼠在出生時 ,其體內(nèi)原始卵泡的數(shù)量是正常小鼠的兩倍。二是激活的 caspase8 將引起 Bcl2 家族中促凋亡成員 Bid 的裂解 , 從而破壞線粒體 ,使其釋放包括細(xì)胞色素 C 在內(nèi)的多種凋亡發(fā)生因子 ,促進凋亡體 (包含有 Apaf1 和 caspase9 酶原 )的形成 ,最終引發(fā)凋亡 [16,17]， 此途徑也成為線粒 體途徑。敲除這些基因就會改變原始卵泡的儲備量 。 卵母細(xì)胞凋亡分子機理 在胚胎性腺中存在著死亡信號 (TNFα、 Fas 配體等 )和存活信號 (LIF、 kit 配體 等 )。包囊在卵泡形成時破裂 ， 那些行使滋養(yǎng)功能的附屬生殖 細(xì)胞全部 “自 我犧牲 ”， 而這一時期也是胚胎生殖細(xì)胞大量丟失的時期。因缺陷死亡理 論認(rèn)為 ， 凋亡能除去減數(shù)分裂時發(fā)生配對錯誤或重組異常的卵母細(xì)胞 ， 即體內(nèi)存在 一個監(jiān)控機制 ， 可發(fā)現(xiàn)并除去有缺陷的卵母細(xì)胞 ， 而保留能正常進行減數(shù)分裂的卵 母細(xì)胞來形成原始卵泡 。被忽視死 亡 ， 是指因不能從環(huán)境中得到足夠 的存活因子而導(dǎo)致的細(xì)胞死亡。因缺陷死亡 (death by defect)。 卵母細(xì)胞凋亡假說 為什么會有如此巨大比例的雌性生殖細(xì)胞發(fā)生凋亡 ？ 人們目前提出了三種學(xué)說 來解釋。 De Pol[10] 等采用原位末端標(biāo)記技術(shù) (TUNEL)，觀察到了懷孕 1820 周的人類胚胎卵巢內(nèi)典型的 2 細(xì)胞因子對牛體外受精胚胎細(xì) 胞凋亡的影響 凋亡細(xì)胞形態(tài) ， 并且還證實 ， 這個時期的胚胎中只有生殖細(xì)胞發(fā)生了凋亡 ， 發(fā) 生凋亡的生殖細(xì)胞比率約為 8%。而在其它哺乳動物中，同等比例的生殖細(xì)胞也會 在卵子發(fā)生的過程中退化閉鎖。在人類中，妊娠 8 周的女性胚胎卵 原細(xì)胞就開始增殖，在第 20 周左右達到峰值，由 1000 個左右迅速分裂達到約 700 萬個。 在胚胎發(fā)育階段，雌性動物卵巢內(nèi)的卵原細(xì)胞 (oogonia)，持續(xù)進行活躍的有絲分裂， 不斷增殖，最后形成初級卵母細(xì)胞，靜止在第一次減數(shù)分裂的雙線期 [5]。在許多無脊椎動物和脊 椎動物中，大量的生殖細(xì)胞在發(fā)育的不同階段丟失 [1,2]。本文通過牛體外受精胚胎培養(yǎng)體系中添加不同細(xì)胞因子，在細(xì)胞層面上 研究其對胚胎早期發(fā)育各個階段細(xì)胞凋亡的影響，對體外受精技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化提供更 多的實驗依據(jù)。細(xì)胞凋亡的分子機制調(diào)控方面國內(nèi)外在體細(xì)胞上取得了很多重大成就。前者是從形態(tài)學(xué)角度提出的概念，而后者是從發(fā)育學(xué)角度提 出的概念。這三位科 學(xué)家因秀麗新桿線蟲模式中細(xì)胞凋亡的卓越成就而分享了 2022 年諾貝爾生理或醫(yī) 學(xué)獎。同年 Brenner 將細(xì)胞凋亡跟基 因調(diào)控聯(lián)系了起來。細(xì)胞凋亡能表現(xiàn)出一些典型的形態(tài)和生化 特征，在附植前胚胎細(xì)胞凋亡評定中也廣泛應(yīng)用了這些特征。 Reproduction） 目 錄 1 引言 ................................................................ 1 卵母細(xì)胞凋亡現(xiàn)象 ................................................ 1 卵母細(xì)胞凋亡假說 ................................................ 2 卵母細(xì)胞凋亡分子機理 ............................................ 2 細(xì)胞凋亡相關(guān)基因 ................................................ 3 胚胎的細(xì)胞凋亡 .................................................. 4 細(xì)胞凋亡檢測方法 ................................................ 4 形態(tài)學(xué)檢測 ..............