【正文】 胱氨酸的攝入對培養(yǎng)條件下細(xì) 18 細(xì)胞因子對牛體外受精胚胎細(xì)胞凋亡的影響 胞內(nèi)保持 GSH 的水平很關(guān)鍵 ， 為 GSH 的合成提供半胱氨酸。 CYS 在 體 外 培 養(yǎng) 體 系 中 的 促 發(fā) 育 作 用 主 要 是 通 過 GSH 實(shí) 現(xiàn) 的 [40,41,42] 。 De Matos [35]等研究發(fā)現(xiàn)， 卵母細(xì)胞來自成年小鼠時(shí)，胚胎發(fā)育中， CYS 能促進(jìn)囊胚發(fā)育，但卵母細(xì)胞來自性 成熟前小鼠時(shí)沒有顯著作用。 200uM CYS 在本實(shí)驗(yàn)中對卵 母細(xì)胞成熟和胚胎發(fā)育均沒有顯著影響。 EGF 對受精后 4細(xì)胞期胚胎的發(fā)育沒有影響 [31]，對囊胚發(fā)育上也沒有顯著效果。當(dāng)用 EGF 處理來源于小 卵泡的牛 COCS 時(shí)候，對卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的進(jìn)程有促進(jìn)作用，但對隨后的胚胎發(fā)育 能力 沒有影響。在山羊，卵母細(xì)胞來源 于羔羊時(shí)，用 EGF 單獨(dú)或與 CYS 共處理卵母細(xì)胞，對成 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文 17 熟沒有顯著影響；而對來源于成年母羊的卵母細(xì)胞，存活率顯著提高。結(jié)果表明， 50ng/ml 的 EGF 對牛卵母細(xì)胞的成熟有顯著促進(jìn)作用，而對胚 胎發(fā)育沒有直接影響。這種差異可能是由于不同的培養(yǎng)體系所造成 的。 胚胎各階段凋亡現(xiàn)象 很多研究顯示，體外發(fā)育胚胎的細(xì)胞凋亡發(fā)生時(shí)間比體內(nèi)發(fā)育胚胎早，而且細(xì) 胞凋亡指數(shù)也高，這可能與體外發(fā)育胚胎所處環(huán)境有關(guān)。 CYS 對牛體外受精胚胎的發(fā)育有明顯的 促進(jìn)作用，囊胚發(fā)育率明顯高于對照組的 （ %和 %， P）。 100uM 濃度的 CYS 對胚胎囊胚率有顯著 提高作用（ % 和 %,P），而且其凋亡指數(shù)顯著低于其他組 ( v. ,)。 50ng/ml 濃度 EGF 和 100uM 濃度 CYS 處理組凋亡指數(shù)顯著低于 對照組(, 和 ， P)，說明成熟液添加適當(dāng)濃度 EGF 或 CYS 能 夠顯著降低胚胎細(xì)胞凋亡。 14 細(xì)胞因子對牛體外受精胚胎細(xì)胞凋亡的影響 試驗(yàn)二 不同濃度 EGF 或 CYS 對牛卵母細(xì)胞成熟的影響 根據(jù)試驗(yàn)一的結(jié)果，胚胎全部培養(yǎng)到第八天，經(jīng)過固定，通透，抽樣做了 TUNEL 染色，激光共聚焦觀察分析細(xì)胞凋亡。典型的凋亡細(xì)胞為既有 TUNEL 陽性標(biāo)記的生化特征，又有細(xì)胞核致密化或者碎片化的形態(tài)學(xué)特征。 試驗(yàn)四，卵母細(xì)胞成熟液和胚胎發(fā)育液添加 EGF 和 CYS 根據(jù)試驗(yàn)二和試驗(yàn)三的結(jié)果，在成熟液中同時(shí)添加 50ng/mlEGF 和 100uMCYS， 并在發(fā)育液中添加 100uMCYS，分析對卵母細(xì)胞成熟，胚胎發(fā)育及胚胎細(xì)胞凋亡的影 響 。 檢測胚胎發(fā)育不同階段細(xì)胞凋亡情況，分析胚胎細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)間。 （ 2）固定和通透。g/mLLH+1181。 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文 11 PI 復(fù)染 PI 是活細(xì)胞常用染核染料，能夠精確地結(jié)合到經(jīng)過通透處理的活細(xì)胞核上，熒 光顯微鏡下非常清晰地標(biāo)記出細(xì)胞位置，區(qū)別于帶有 FITC 標(biāo)記的凋亡細(xì)胞。隨機(jī)選出 23 個(gè)通透好的胚胎，先用 DNase+DNAbuffer 中處理 40min，再用 TUNEL 試劑盒處理。 TUNEL 試劑盒處理前準(zhǔn)備工作 TUNEL 操作流程總結(jié)見圖 1. 胚胎固定 使用 固定液 4%的多聚甲醛，固定收集的各階段胚胎。使用時(shí)整個(gè)操作過程需在冰上且暗環(huán)境里完 10 細(xì)胞因子對牛體外受精胚胎細(xì)胞凋亡的影響 成，以保證末端轉(zhuǎn)移酶活性。細(xì)胞發(fā)生凋亡的時(shí)候，細(xì)胞核 內(nèi) DNA 會(huì)被脫氧核糖核酸內(nèi)切酶降解成 180200bp 左右長度的寡核苷酸片段，隨后 發(fā)生一系列大分子物質(zhì)的降解反應(yīng)，最終形成凋亡小體致使細(xì)胞死亡。 6h 后，將受精后胚胎撿起，用發(fā)育液（ CR 1）洗三遍，放入提前配好并平衡 2h 以上的發(fā)育液里，也是 20 個(gè) /100ul 微滴規(guī)格 。 取凍精細(xì)管一支，置于 37℃ 水浴鍋中 1min，用滅菌吸水紙擦拭凍精細(xì)管，剪開 細(xì)管封口將解凍的精液緩慢流入已平衡 2h 的含 7ml BO 液 (含 咖啡因 )的 15ml 離心管中， 1800r/5min 分別離心兩次，去掉上清，留下 600800ul 液，用于做體外 受精。一般撿取 A,B 級(jí)卵母 細(xì)胞用于體外成熟及體外受精。g/mLE2 +8181。 撿卵及成熟培養(yǎng) 在體視顯微鏡下，挑選卵胞質(zhì)均勻、卵丘細(xì)胞層完整且至少有 35 層以上的 COCs （卵丘 卵母細(xì)胞復(fù)合體），在洗卵液（ PBS+2%FBS+10181。我們使用的是實(shí)驗(yàn)室常用的第三種獲取卵母細(xì)胞的方法。第二種方法是借助超聲波探測儀，內(nèi)窺 鏡等直接從實(shí)驗(yàn)動(dòng)物活體卵巢中抽取卵母細(xì)胞。不同用途針直徑不同：撿卵母細(xì)胞的針要拉的稍微粗一點(diǎn)，因?yàn)? 有卵丘細(xì)胞層包圍著；最粗的針是移成熟后卵母細(xì)胞的針，此時(shí)經(jīng)過成熟培養(yǎng)卵丘 細(xì)胞層擴(kuò)展變松散，使 COCs 的直徑變大，卵丘細(xì)胞層的擴(kuò)展也是卵母細(xì)胞成熟的一 個(gè)標(biāo)志；最細(xì)的針為移受精后胚胎的針，此時(shí)由于精子的活動(dòng)和精子入卵，使卵丘 細(xì)胞層脫落，卵母細(xì)胞外圍僅包圍著 12 層卵丘細(xì)胞，所以 COCs 直徑較小，此時(shí)用 細(xì)一點(diǎn)的針可以將胚胎洗的更干凈，擺脫多余精子和雜質(zhì)的影響，更有利于胚胎的 發(fā)育。據(jù)研究， CYS 能夠細(xì)胞質(zhì)成熟，在體外受精中促進(jìn)雄原核的形成。 Coskun 等報(bào)道 EGF 能顯著提高牛成熟卵母細(xì)胞原核形成率，卵裂率及 4～ 8 細(xì)胞率。這對家畜進(jìn)行體外受精并規(guī)?；a(chǎn)以及瀕危動(dòng)物的人工繁殖等 都非常有意義。本實(shí)驗(yàn)采用 TUNEL 方法和激光共聚焦顯微鏡結(jié)合的 方式檢測細(xì)胞凋亡。 Caspase3 通常以 酶原（ 32 KD16）的形式存在于胞漿中，在凋亡的早期階段被激活，活化的 Caspase3 由兩個(gè)大亞基（ 17KD）和兩個(gè)小亞基（ 12 KD）組成，裂解相應(yīng)的胞漿胞核底物，最 終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡?？贵w夾心酶聯(lián)免疫分析法可以測定核小體單體 和寡聚核小體，因而可以用于許多不同的培養(yǎng)細(xì)胞株或動(dòng)物組織細(xì)胞的凋亡檢測。 該法是利用 “夾心定量酶標(biāo)免疫測定法 ”的原理，用抗組蛋白－生物素和抗 DNA－ 過氧化物酶（ POD）分別結(jié)合到核小體的組蛋白和 DNA 成分上，洗滌除去未結(jié)合的抗 體后，加入 POD 底物產(chǎn)生顏色反 應(yīng)。 近年來隨著熒光定量 PCR 技術(shù)的發(fā)展，用定量 PCR 技術(shù)檢測基因表達(dá)水平更快更準(zhǔn) 確。 PCR 即是檢測這些特異性基因的常用方法。凋亡細(xì)胞中提取的 DNA 進(jìn)行常規(guī)的瓊脂糖凝膠電泳，并用 EB 進(jìn)行染色時(shí)， 這些大小不同的 DNA 片段就呈現(xiàn)出梯狀條帶 [29]。OH 末端，從而進(jìn)行凋亡細(xì)胞的檢測。在細(xì)胞凋亡中，染色體 DNA 雙鏈斷裂或單 鏈斷裂而產(chǎn)生大量的粘性 339。 AnnexinV 進(jìn)行熒光素（ FITC、 PE）或生物素標(biāo)記，以標(biāo)記了的 AnnexinV 作為熒光探針利用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡可檢測細(xì)胞凋亡的發(fā)生。 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文 5 生化檢測 細(xì)胞凋亡的生化特征最主要是 DNA 核小體間的斷裂，產(chǎn) 50300kb 或 180200bp 整數(shù)倍的多聚核苷酸片段，在瓊脂糖凝膠上呈梯形電泳圖譜 (DNA ladder， 1980)； 膜結(jié)構(gòu)對稱性喪失，并 PS 顆粒外翻；細(xì)胞中具 Caspase3 酶的活性表達(dá)；細(xì)胞中促 凋亡基因與抗凋亡基因表達(dá)等都是重要的生化特征。凋亡小體很快被噬細(xì)胞或鄰接細(xì)胞所吞噬。在物理化學(xué)或者人 為誘導(dǎo)的情況下，凋亡發(fā)生的時(shí)間可在 EGA 之前。體外培養(yǎng)環(huán)境中存在不利于胚胎發(fā)育的物理化學(xué)因素刺激或者培 養(yǎng)液缺乏胚胎所需的一些重要細(xì)胞因子或激素都是造成此現(xiàn)象的原因。他們證明 BCL2L10 與微管蛋白結(jié)合，卵胞質(zhì)周 圍參與時(shí)間特異性重新分配，直接調(diào)控腫瘤蛋白和線粒體。 由上可見 ,Bax 對于細(xì)胞色素 C 的釋放起著關(guān)鍵的作用，在凋亡信號(hào)的刺激下 Bax 可從胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到線粒體膜上 ,從而啟動(dòng)線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡?？沟蛲龅鞍字挥性诘? PH（ PH 低于 ） 條件下形成通道的活動(dòng) ， 這表示在生理?xiàng)l件下也可能存在形成通道的活動(dòng)。有人發(fā)現(xiàn) [23]， 凋亡的誘導(dǎo)不依賴于 P53 抑制劑 ， 而是依賴于 Bak 或者 Bax。抗凋亡與其他抗凋亡成員間 ， 促凋亡和其 他促凋亡成員間 ， 還有抗凋亡和促凋亡成員間能夠隨意地互相作用 ， 形成二聚體或多聚體。 tPA 與顆粒細(xì) 胞中表達(dá)的抑制素 α 相互作用 ， 可能對卵泡破裂、成熟卵子的釋放和未成熟卵子的 閉鎖均起作用。這說明促性腺激素可能通過誘導(dǎo) NAIP 的表達(dá)影響顆粒細(xì)胞的存活 ， 從而間接影響卵母細(xì)胞的凋亡或存活 [22]?？梢娛笈呗殉仓械穆涯讣?xì)胞在暴露于 PAHs 后 ， 是通過一個(gè) AHR 依賴的方式增加 Bax 的表達(dá)來促發(fā)凋亡的 [19]。這表明 AHR 的基因 水平對于胎兒卵巢發(fā)育過程中卵母細(xì)胞凋亡的數(shù)量起著決定性作用。 Fas 配體與卵母細(xì)胞上的 Fas 受體結(jié)合 ,可能激活 caspase8 前體 ,因此打開了誘導(dǎo) 卵母細(xì)胞凋亡的兩個(gè)途徑 : 一個(gè)途徑是產(chǎn)生高水平的 caspase8,直接啟動(dòng) caspase 效應(yīng)分子的級(jí)聯(lián)反應(yīng) ， 也稱 為死亡受體途徑 ?？梢姲抑? 的滋養(yǎng)細(xì)胞是通過 “自我犧牲 ”凋亡來實(shí)現(xiàn)卵母細(xì)胞的發(fā)育和成熟的。這方面的證據(jù)多來自于對小鼠的研究 。被忽視死亡 (death by neglect)。 Ratts[9]等在懷孕 天之后的鼠胚卵巢細(xì)胞中， 證實(shí)了其 DNA 被切割為 180200bp 不同倍數(shù)的片段，電泳呈梯狀條帶分布。這時(shí)候生 殖細(xì)胞的數(shù)目會(huì)急劇下降，絕大多數(shù)發(fā)生死亡。 卵母細(xì)胞凋亡現(xiàn)象 卵母細(xì)胞與其他類型細(xì)胞一樣，也在不斷地退化死亡。 細(xì)胞凋亡是一個(gè)凋亡相關(guān)多 基因之間相互作用的，眾多蛋白質(zhì)參與的復(fù)雜信號(hào) 轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。此后 Brenner,Horvitz,Sulston 等科學(xué)家繼續(xù)研究細(xì)胞凋亡的 分子機(jī)制，并描述了 Bcl2 家族， P53 等細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的調(diào)控機(jī)制。在體外生產(chǎn)的胚胎發(fā)育過程中，不利的環(huán)境因素會(huì)增加細(xì)胞凋亡率，因此 細(xì)胞凋亡的生物學(xué)意義受到了廣泛關(guān)注。 In Vitro Fertilized Embryo。 CYS 可以提高牛胚胎體外發(fā)育能力。結(jié)果表明，同時(shí)添加 EGF 或 CYS 對牛卵母細(xì)胞的成熟及胚胎的發(fā)育沒有產(chǎn)生疊 加效應(yīng)。結(jié)果表明 EGF 對牛胚胎體外發(fā)育沒有明顯影響。結(jié)果表明 50ng/ml EGF 顯著提高卵母細(xì)胞的卵裂率。結(jié)果表明， 對于牛體外受精胚胎，凋亡信號(hào)最早出現(xiàn)于 16 細(xì)胞期，隨著胚胎的發(fā)育，凋亡發(fā)生 比率也增加。 分類號(hào) S823 學(xué)校代碼 10129 U D C636 學(xué) 號(hào) 08202209 細(xì)胞因子對牛體外受精胚胎細(xì)胞凋亡的影響 Effect of Cytokines on Cell Apoptosis of Bovine In Vitro Fertilized(IVF) Embryos 申 請 人：蘇米雅 學(xué)科門類：農(nóng) 學(xué) 學(xué)科專業(yè)：動(dòng)物遺傳育種與繁殖 研究方向：動(dòng)物繁殖生物學(xué)與繁殖技術(shù) 指導(dǎo)教師：張家新 教 授 論文提交日期： 二〇一一年五月 0 要 本研究通過在牛卵母細(xì)胞成熟液和胚胎發(fā)育液中添加不同濃度的表皮生長因子 （ EGF）和半胱胺（ CYS），比較其對牛卵母細(xì)胞成熟和胚胎發(fā)育的影響，利用 TUNEL 檢測法，檢測了不同處理?xiàng)l件下胚胎細(xì)胞的凋亡情況。 16 細(xì) 胞凋亡率為 26%，桑葚胚凋亡率為 83%，囊胚為 97%,擴(kuò)展囊胚和 孵化囊胚為 100%。說明 EGF 對卵母細(xì)胞成熟有促進(jìn)作用。在胚胎發(fā)育液中添加 100uMCYS 可以明顯提高 胚胎發(fā)育能力，囊胚率顯著高于對照組（ v. ,P），囊胚的凋亡指數(shù) 顯著低于其他組 ( v. , P)。 以上結(jié)果表明，（ 1）牛體外受精胚胎，凋亡信號(hào)最早出現(xiàn)于 16 細(xì)胞期，隨著胚 胎的發(fā)育，凋亡發(fā)生比率也增加。（ 4）在成熟 液和發(fā)育液中同時(shí)添加 EGF 和 CYS 可以提高牛卵母細(xì)胞成熟和胚胎的發(fā)育，但不產(chǎn) 生疊加效應(yīng)。 Cell Apoptosis。細(xì)胞凋亡能表現(xiàn)出一些典型的形態(tài)和生化 特征，在附植前胚胎細(xì)胞凋亡評(píng)定中也廣泛應(yīng)用了這些特征。這三位科 學(xué)家因秀麗新桿線蟲模式中細(xì)胞凋亡的卓越成就而分享了 2022 年諾貝爾生理或醫(yī) 學(xué)獎(jiǎng)。細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制調(diào)控方面國內(nèi)外在體細(xì)胞上取得了很多重大成就。在許多無脊椎動(dòng)物和脊 椎動(dòng)物中，大量的生殖細(xì)胞在發(fā)育的不同階段丟失 [1,2]。在人類中，妊娠 8 周的女性胚胎卵 原細(xì)胞就開始增殖，在第