【正文】 20 周左右達到峰值，由 1000 個左右迅速分裂達到約 700 萬個。 De Pol[10] 等采用原位末端標記技術(shù) (TUNEL)，觀察到了懷孕 1820 周的人類胚胎卵巢內(nèi)典型的 2 細胞因子對牛體外受精胚胎細 胞凋亡的影響 凋亡細胞形態(tài) ， 并且還證實 ， 這個時期的胚胎中只有生殖細胞發(fā)生了凋亡 ， 發(fā) 生凋亡的生殖細胞比率約為 8%。因缺陷死亡 (death by defect)。因缺陷死亡理 論認為 ， 凋亡能除去減數(shù)分裂時發(fā)生配對錯誤或重組異常的卵母細胞 ， 即體內(nèi)存在 一個監(jiān)控機制 ， 可發(fā)現(xiàn)并除去有缺陷的卵母細胞 ， 而保留能正常進行減數(shù)分裂的卵 母細胞來形成原始卵泡 。 卵母細胞凋亡分子機理 在胚胎性腺中存在著死亡信號 (TNFα、 Fas 配體等 )和存活信號 (LIF、 kit 配體 等 )。二是激活的 caspase8 將引起 Bcl2 家族中促凋亡成員 Bid 的裂解 , 從而破壞線粒體 ,使其釋放包括細胞色素 C 在內(nèi)的多種凋亡發(fā)生因子 ,促進凋亡體 (包含有 Apaf1 和 caspase9 酶原 )的形成 ,最終引發(fā)凋亡 [16,17]， 此途徑也成為線粒 體途徑。此外 ， AHR 對 于多環(huán)芳香烴 [PAHs] （ 一類在環(huán)境如香煙中廣泛存在 ， 已知會引起胚胎期雌性生 殖細胞死亡的化學(xué)物質(zhì) ） 也是一種很好的受體。胚胎時期生殖細胞的大量丟失與 成體中發(fā)生的卵泡閉鎖雖然本質(zhì)上都是細胞凋亡 ， 但它們遵循 的卻是不同的調(diào)控機 制。在這種類型 的閉鎖中 ， 可 觀察到顆粒細胞的 DNA 電泳呈典型的凋亡形狀分布。 細胞凋亡相關(guān)基因 近年來 , Bcl2 基因蛋白家族作用機制方面進行了大量研究 ,對其已有了一定的 了解 ,并提出了幾種作用模式 ,但確切的機制尚未確定。當大部分 成員間隨意作用時 ， 死亡促進因子和死亡抑制因子間的有些相互作用是可能高度專 一的 （ 比如 Bok 與 Mcl1 間 ） 。 此外 ， 當?shù)蛲霭l(fā)生時 BH3 單結(jié)構(gòu)域蛋白 Bim 水平提高 ， 而 Mcl1 和 Bik 水平保持不 變。脂質(zhì)體的研究中顯示 ， Bclxl 能 4 細胞因子對牛體外受精胚胎細胞凋亡的影響 刺激 VDAC 的關(guān)閉，而 Bax 和 Bak 能促進其開啟，這可能使細胞色素 C 的通過?？沟蛲鲱? Bcl2 蛋白可以通過阻止促凋亡蛋白在線粒體膜上形成低聚體來發(fā)揮其抗凋亡作用 [26]。在死亡的卵母細胞， BCL2L10 與促凋亡 BAX 共定位，并且中和 BCL2L10 會加速卵母細胞死亡。動物受精后 胚胎基因組并不是立即轉(zhuǎn)錄表達的，而是先表達母源基因組，再表達胚胎基因組。 細胞凋亡檢測方法 形態(tài)學(xué)檢測 形態(tài)學(xué)檢測是依據(jù)細胞凋亡過程中所表現(xiàn)出來的一些形態(tài)學(xué)特征來判定凋亡。一般認為，凋亡小 體幾分鐘即可形成，被吞噬的凋亡小體可在細胞內(nèi)存留數(shù)小時 [28]。以下介紹幾種常用生化檢測方 法。碘 化丙啶（ Propidine iodide,PI）是一種核酸染料，它不能透過完整的細胞膜，但在 凋亡中晚期的細胞和死細胞， PI 能夠透細胞膜而使細胞核紅染。OH 末端，而正常的或正在增殖的細胞幾乎沒有 DNA 的 斷裂，因而沒有 339。原位 TUNEL 法快速， 其反應(yīng)全過程僅需約 3 h，其靈敏度及特異性都較高，尤其適用于作有關(guān)細胞凋亡 與相關(guān)基因表達關(guān)系方面的研究。而壞死細胞 DNA 電泳后則呈模糊的 涂片狀。 如 LMPCR 被用來擴增凋亡細胞產(chǎn)生的 DNA 片段。此外，將 PCR 技術(shù)和核酸分子雜交技術(shù)相結(jié)合，能顯著提高檢測的特異性和靈 敏度。通過酶標測定儀分析，即可定量反映細胞凋亡 的水平。 線粒體膜勢能的檢測 線粒體在細胞凋亡的過程中起著樞紐作用，多種細胞凋亡刺激因子均可誘導(dǎo)不 同的細胞發(fā)生凋亡，而線粒體跨膜電位 DYmt 的下降，被 認為是細胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)過 程中最早發(fā)生的事件，它發(fā)生在細胞核凋亡特征（染色質(zhì)濃縮、 DNA 斷裂）出現(xiàn)之 前，一旦線粒體 DYmt 崩潰，則細胞凋亡不可逆轉(zhuǎn)。但在細胞凋亡的晚期和死亡細胞， Caspase3 的活性明顯下降。 胚胎細胞凋亡研究展望 在哺乳動物中，雌性生殖細胞的存活與凋亡調(diào)控是多因子參與的復(fù)雜調(diào)節(jié)過程。 Coskun 和 Erickson 等的研究表明，表皮生長因子（ EGF）、胰島素樣生長因子 （ IGF）、轉(zhuǎn)移生長因子 (TGF)等生長因子都能不同程度地促進小鼠、大鼠、牛、豬、 倉鼠等卵母細胞的體外成熟。 Arellano 等的研究結(jié)果表明， EGF 能顯著提高豬卵母細胞的體外成熟率。有些研究顯示， CYS 對卵母細 胞的成熟沒有影響但能夠促進囊胚率和孵化囊胚率。 卵母細胞的準備 卵母細胞的準備：一般情況下，卵母細胞的獲取主要有三種方法。在家畜采卵一般經(jīng)過體外成熟才能 受精。 從屠宰場收集牛的卵巢，放置于 30℃ 滅菌的 %生理鹽水中， 12h 內(nèi)送到實 驗室。L PS）中沖洗 3 遍，然后在成 熟培養(yǎng)液 (M199+10%FBS+10181。L/mL PS)里清洗 3 遍， 轉(zhuǎn)入已平衡 2h 以上的 35mm 培養(yǎng)皿的微滴中 (每滴為 100181。 精子獲能 哺乳動物釋放的 精子不能立即使卵子受精，必須在雌性動物生殖道內(nèi)停留一段 時間才能獲得受精能力，此過程為精子獲能。 體外受精 將成熟培養(yǎng) 2224h 的卵母細胞取出，用受精液（ BO 液 +20ug/ml 肝素鈉）洗三 遍，轉(zhuǎn)入事先準備好并平衡 2h 以上的受精液滴里， 50ul 液滴放置 20 左右卵母細胞。 胚胎培養(yǎng)及發(fā)育 卵母細胞做完體外受精后，培養(yǎng) 48h 后換半液。當末端轉(zhuǎn)移 酶 TdT 將帶有 FITC 熒光標記的寡核苷酸片段連接到斷裂末端時，在熒光顯微鏡下會 觀察到被熒光標記的細胞，以判斷細胞發(fā)生了凋亡。具體操作如下：在冰上的多孔板里做一個 9ul 的帶有 FITC 熒光的寡核苷酸標記液微滴，蓋上礦物油（避免在 ℃ 培 養(yǎng)箱孵育時操作液 的蒸發(fā)），迅速加 1ul 的 TdT 酶液，充分混合兩種物質(zhì)，標記液和酶液比例為 9:1， 然后快速將準備好的胚胎放入微滴中，將多孔板放到 ℃ ,5%CO2 培養(yǎng)箱孵育 12h。實際操作如下：將從發(fā)育 液撿取的胚胎用 4%的多聚甲醛洗三遍，再移入多聚甲醛液滴中，固定 12h。 （ 2） TUNEL 陰性對照 為檢測熒光標記是否標上，作陰性對照，隨機挑選 23 個通透好的胚胎，用 TUNEL 處理時不加酶液，只在標記液中處理 12h。 制片并用激光共聚焦觀察 滅菌載玻片上放置 36 個胚胎，四周涂抹中性樹脂膠，輕輕蓋上蓋玻片，裝到 裝片的盒子，放 20℃ 保存，一周之內(nèi)用激光共聚焦觀察，照相，做統(tǒng)計分析。g/mLE2 +8181。 （ 3）抽樣做 TUNEL 染色處理，檢測細胞凋亡。比較不同 發(fā)育階段囊胚（囊胚，擴張囊胚，孵化囊胚）之間的胚胎細胞凋亡情況。 統(tǒng)計分析 所得實驗數(shù)據(jù)如卵裂率，囊胚率使用卡方檢驗分析，確定差異顯著性；胚胎的 凋亡細胞和細胞總數(shù)使用細胞計數(shù)軟件統(tǒng)計；細胞凋亡指數(shù)用 SAS 軟件分析差異性。 內(nèi)蒙古 農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文 13 結(jié)果 試驗一 胚胎發(fā)育各階段細胞凋亡情況 胚胎體外受精完成后，收集 2細胞， 3細胞， 4細胞， 8細胞， 16細胞，桑 椹胚，囊胚，擴展囊胚及孵化囊胚，固定和通透以后隨機抽樣做 TUNEL 染色處理， 用激光共聚焦顯微鏡檢測細胞凋亡。 表 3 不同濃度 EGF 或 CYS 對牛卵母細胞成熟的影響 Effect of different concentrations of EGF or CYS on bovine oocytes maturation 添加因子 濃度 卵母細胞數(shù) 卵裂數(shù)（ %） 囊胚數(shù)（ %） 凋亡指數(shù)（ AI） 對照組 240 188（ ） b 54（ ） c EGF 50 240 208（ ） a 83()a （ ng/ml） 100 240 190（ ） b 59()c CYS 100 240 193（ ） b 70()b (uM) 200 250 189（ ） b 55()c 注 ： 卵裂率 =卵裂數(shù)除以卵母細胞總數(shù)；囊胚率 =囊胚數(shù)除以卵裂數(shù)；同列數(shù)據(jù)后面標注的不同小寫字母表示 差異顯著（ P＜ ），相同的小寫字母表示差異不顯著（ P） 由表得出， 50ng/ml 濃度 EGF 對卵母細胞的卵裂率提高顯著（ %和 %， P），從而對囊胚率有顯著影響，凋亡指數(shù)顯著低于對照組（ 和 ， P）。 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文 15 試驗三 不同濃度 EGF 或 CYS 對牛體外受精胚胎發(fā)育的影響 根據(jù)試驗一的結(jié)果，胚胎全部培養(yǎng)到第八天，經(jīng)過固定，通透，抽樣做了 TUNEL 染色，激光共聚焦觀察分析細胞凋亡。說明 CYS 對胚胎囊胚率有明顯促進作用，能夠顯著降 低胚胎細胞凋亡。成熟液加 EGF，發(fā)育液加 CYS 時對胚胎囊胚率產(chǎn)生了非 常顯著的促進作用 (%,%和 %,P),且這兩組凋亡指數(shù)也顯著低于 對照組（ , 和 ， P0,05），說明添加 EGF 和 CYS 能夠顯著改善胚胎 發(fā)育質(zhì)量。體外發(fā)育跟體內(nèi)發(fā)育相比， 發(fā)育不同階段缺少關(guān)鍵生長因子等導(dǎo)致發(fā)育質(zhì)量受影響。體外發(fā)育胚胎可通過改善培養(yǎng)環(huán)境，優(yōu)化培養(yǎng)體系來提高胚胎的質(zhì)量，推遲凋 亡出現(xiàn)的時間。 在本研究中，在成熟液中添加 EGF 顯著提高了牛卵母細胞成熟受精后的卵裂率 和囊胚率，這與 Guler 和 GrazulBilska 等的研究結(jié)果一致。在成年母牛 和小牛，成熟液添加 EGF 顯著提高卵母細胞卵裂率和囊胚率。 EGF 在小卵泡中的濃度比大卵泡的濃度高，卵丘細胞能介導(dǎo) EGF 的 影響，卵丘細胞數(shù)較少的羔羊與成年羊相比，生長因子的正常作用受到限制。 EGF 的受體超家族之一的 erbB3 的轉(zhuǎn)錄因子，在胚胎 2細胞階段存在，而 4到 16 細胞階段不存 在，但在囊胚階段重新被檢測到。 CYS 在卵母細胞成熟液和胚胎發(fā)育液均添加的時候，有顯著的促進成熟和發(fā)育 的作用，而且顯著降低胚胎細胞凋亡指數(shù)。這些發(fā)現(xiàn)顯示， CYS 對卵母細胞成熟和胚胎發(fā)育的影 響，均與卵母細胞的供體物種和成熟狀態(tài)有 關(guān)。 GSH （ glutathione）是谷胱甘肽的縮寫。 GSH 的合成通過 γ谷氨 酰循環(huán) （ γgluta。 CYS 是 GSH 的 前體，低分子量硫醇（ thiol）合成半胱胺 （ cysteamine CYS）能減少胱氨酸（ cystine）形成半胱氨酸（ cysteine）的幾率， 從而在卵母細胞成熟液添加 CYS 能增加 GSH 的合成。 CYS 在成熟液添加，對卵裂和囊胚沒有顯著作用而能夠促進孵化率的作用 機制目前還有待繼續(xù)研究。卵母細胞來自成年母 山羊時，成熟液添加 200uM 的 CYS 能促進囊胚的發(fā)育，但 100200uM CYS 濃度對性 成熟前的山羊體外發(fā)育卵裂率和囊胚發(fā)育率沒有顯著影響。 CYS 對卵母細胞成熟及胚胎發(fā)育的影響 在本研究中，添加 100uM CYS 對卵母細胞的成熟有一定促進作用，但是卵裂率 上沒有顯著表現(xiàn)出來，而在囊胚率上表現(xiàn)為提高效應(yīng)。 EGF 促進卵母細胞減數(shù)分裂恢復(fù)和極體的形成，促進卵丘細胞的擴展。 這種差異現(xiàn)象可能跟卵母細胞的供體卵泡環(huán)境有關(guān) [32]。 但是 EGF 對來源于羔羊的卵母細胞，只對其成熟有促進作用，而對囊胚率卻沒有影 響。 EGF 對卵母細胞成熟及胚胎發(fā)育的影響 有報道表明低濃度的 EGF（ 1,5,25ng/ml）對牛胚胎早期發(fā)育沒有顯著影響 [31]， 在本研究中比較了兩個較高濃度 EGF（ 50,100ng/ml）對牛卵母細胞成熟和胚胎發(fā)育 的影響。 本實驗中胚胎最早出現(xiàn)的細胞凋亡時間是 16 細胞，有的研究顯示體外發(fā)育的 牛胚 胎， 8細胞期觀察到了細胞凋亡現(xiàn)象。 討論 本實驗的目的是在牛卵母細胞成熟液和胚胎發(fā)育培養(yǎng)液中添加不同細胞因子， 從卵裂率，囊胚率，囊胚細胞凋亡指數(shù)等參數(shù)來分析，細胞因子 EGF 和 CYS 對卵母 細胞成熟和胚胎發(fā)育的影響。 組一，成熟液添加 EGF（ 50ng/ml） +CYS（ 100uM），發(fā)育液添加 CYS（ 100uM） 組二，成熟液添加 EGF（ 50ng/ml），發(fā)育液均添加 CYS（ 100uM） 組三，發(fā)育液添加 CYS（ 100uM） 表