【正文】 ...................................... 4 生化檢測(cè) ...................................................... 5 2 實(shí)驗(yàn)研究 ............................................................ 8 實(shí)驗(yàn)方法 ........................................................ 8 口吸撿卵針的準(zhǔn)備 .............................................. 8 卵母細(xì)胞的準(zhǔn)備 ................................................ 8 撿卵及成熟培養(yǎng) ................................................ 8 精子獲能 ...................................................... 9 體外受精 ...................................................... 9 胚胎培養(yǎng)及發(fā)育 ................................................ 9 TUNEL 試劑盒工作原理 ........................................... 9 TUNEL 試劑盒處理前準(zhǔn)備工作 .................................... 10 試驗(yàn)設(shè)計(jì) ....................................................... 12 統(tǒng)計(jì)分析 ....................................................... 12 結(jié)果 ........................................................... 13 試驗(yàn)一 胚胎發(fā)育各階段細(xì)胞凋亡情況 ............................ 13 試驗(yàn)二 不同濃度 EGF 或 CYS 對(duì)牛卵母細(xì)胞成熟的影響 ............. 14 試驗(yàn)三 不同濃度 EGF 或 CYS 對(duì)牛 體外受精胚胎發(fā)育的影響 .......... 15 試驗(yàn)四 EGF 和 CYS 對(duì)牛卵母細(xì)胞成熟和體外受精胚胎發(fā)育發(fā)育的影響 . 15 討論 ........................................................... 16 胚胎各階段凋亡現(xiàn)象 ........................................... 16 EGF 對(duì)卵母細(xì)胞成熟及胚胎發(fā)育的影響 ............................ 16 CYS 對(duì)卵母細(xì)胞成熟及胚胎發(fā)育的影響 ............................ 17 結(jié)論 ........................................................... 18 致 謝 .............................................................. 19 參 考 文 獻(xiàn) ........................................................ 20 附 圖 ................................................................................................................................ 24 作 者 簡(jiǎn) 介 ...................................................................................................................... 33 0 略 語(yǔ) 表 FSH(Follicle Stimulating Hormone) 促卵泡素 LH (Luteinizing Hormone) 促黃體素 E2 (Estradiol) 雌二醇 FBS (Fetal Bovine Serum) 胎牛血清 ICM（ inner cell mass） 內(nèi)細(xì)胞團(tuán) TE（ Trophectoderm） 滋養(yǎng)層細(xì)胞 AI（ Apoptosis index） 凋亡指數(shù) PBS (Phosphate Buffered Saline) 磷酸緩沖液 EGF(Epidermal growth factor) 表皮生長(zhǎng)因子 CYS(Cysteamine) 半胱胺 PS(PenicillinStreptomycin) 青 鏈霉素雙抗 TUNEL(terminaldeoxynucleotidyl 脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端 transferase mediated nick end labeling) 標(biāo)記法 DNase I(Deoxyribonuclease) 脫氧核糖核酸酶 I RNase A(Ribonuclease A) 核糖核酸酶 A PI(Propidium iodide) 碘化丙啶 PVP (Pohyvinylpyrolidone) 聚乙烯吡咯烷酮 COCs (Cumulus Oocyte Complexes) 卵丘細(xì)胞 卵母細(xì)胞復(fù)合體 GSH（ Glutathione） 谷胱甘肽 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文 1 1 引言 細(xì)胞凋亡可以在很多哺 乳動(dòng)物胚胎的附植前發(fā)育過(guò)程觀察到，它參與細(xì)胞增殖 和孕體的形成過(guò)程，起到清除不正常和功能失常細(xì)胞的作用，并表現(xiàn)出進(jìn)化上的保 守機(jī)制。 Cell Apoptosis。 CYS could improve development of bovine embryo. (4)Supplement with EGF and CYS together could improve bovine oocyte maturation and embryo developmet, but without accumulated effect. Key words： Bovine。（ 4）在成熟 液和發(fā)育液中同時(shí)添加 EGF 和 CYS 可以提高牛卵母細(xì)胞成熟和胚胎的發(fā)育，但不產(chǎn) 生疊加效應(yīng)。（ 3） EGF 對(duì)牛胚胎體外發(fā)育沒(méi)有明顯影響。 以上結(jié)果表明，（ 1）牛體外受精胚胎，凋亡信號(hào)最早出現(xiàn)于 16 細(xì)胞期，隨著胚 胎的發(fā)育，凋亡發(fā)生比率也增加。 試驗(yàn)四，比較了在牛卵母細(xì)胞成熟液和胚胎發(fā)育液中同時(shí)添加 EGF 或 CYS 的效 果。在胚胎發(fā)育液中添加 100uMCYS 可以明顯提高 胚胎發(fā)育能力，囊胚率顯著高于對(duì)照組（ v. ,P），囊胚的凋亡指數(shù) 顯著低于其他組 ( v. , P)。 試驗(yàn)三，比較了在牛胚胎發(fā)育液中添加不同濃度 EGF 或 CYS 的效果。說(shuō)明 EGF 對(duì)卵母細(xì)胞成熟有促進(jìn)作用。 試驗(yàn)二，比較不同濃度 EGF 或 CYS 對(duì)牛卵母細(xì)胞成熟的影響。 16 細(xì) 胞凋亡率為 26%，桑葚胚凋亡率為 83%，囊胚為 97%,擴(kuò)展囊胚和 孵化囊胚為 100%。研究結(jié)果如下： 試驗(yàn)一，研究了牛體外受精胚胎在不同發(fā)育階段的細(xì)胞凋亡情況。 分類(lèi)號(hào) S823 學(xué)校代碼 10129 U D C636 學(xué) 號(hào) 08202209 細(xì)胞因子對(duì)牛體外受精胚胎細(xì)胞凋亡的影響 Effect of Cytokines on Cell Apoptosis of Bovine In Vitro Fertilized(IVF) Embryos 申 請(qǐng) 人：蘇米雅 學(xué)科門(mén)類(lèi)：農(nóng) 學(xué) 學(xué)科專(zhuān)業(yè)：動(dòng)物遺傳育種與繁殖 研究方向：動(dòng)物繁殖生物學(xué)與繁殖技術(shù) 指導(dǎo)教師：張家新 教 授 論文提交日期： 二〇一一年五月 0 要 本研究通過(guò)在牛卵母細(xì)胞成熟液和胚胎發(fā)育液中添加不同濃度的表皮生長(zhǎng)因子 （ EGF）和半胱胺（ CYS），比較其對(duì)牛卵母細(xì)胞成熟和胚胎發(fā)育的影響，利用 TUNEL 檢測(cè)法，檢測(cè)了不同處理?xiàng)l件下胚胎細(xì)胞的凋亡情況。為牛卵母細(xì)胞和胚胎體外發(fā) 育的提高提供理論基礎(chǔ)。結(jié)果表明， 對(duì)于牛體外受精胚胎，凋亡信號(hào)最早出現(xiàn)于 16 細(xì)胞期，隨著胚胎的發(fā)育，凋亡發(fā)生 比率也增加。在囊胚階段，細(xì)胞凋亡指數(shù)也隨發(fā)育進(jìn)行呈現(xiàn)上升趨勢(shì)（囊胚凋 亡指數(shù)為 ，擴(kuò)展囊胚為 , 孵化囊胚為 ）。結(jié)果表明 50ng/ml EGF 顯著提高卵母細(xì)胞的卵裂率。在成熟液 中添加 CYS 對(duì)卵母細(xì)胞卵裂率和囊胚率沒(méi)有顯著影響，但 50ng/ml 濃度 EGF 和 100uM 濃度 CYS 處理組的囊胚凋亡指數(shù)都顯著低于對(duì)照組 (, v. )，說(shuō)明 成熟液添加適當(dāng)濃度 EGF 或 CYS 能夠顯著提高牛卵母細(xì)胞的質(zhì)量。結(jié)果表明 EGF 對(duì)牛胚胎體外發(fā)育沒(méi)有明顯影響。說(shuō)明 CYS 對(duì)牛胚 胎體外發(fā)育有明顯促進(jìn)作用。結(jié)果表明，同時(shí)添加 EGF 或 CYS 對(duì)牛卵母細(xì)胞的成熟及胚胎的發(fā)育沒(méi)有產(chǎn)生疊 加效應(yīng)。（ 2） EGF 和 CYS 可以促進(jìn)卵母細(xì)胞成熟。 CYS 可以提高牛胚胎體外發(fā)育能力。 關(guān)鍵詞： 牛；體外受精胚胎；細(xì)胞凋亡；細(xì)胞因子 Effect of Cytokines on Cell Apoptosis of Bovine In Vitro Fertilized(IVF) Embryos Abstract In this study, development of oocyte and embryo of bovine were examined after epidermal growth factor (EGF) and cysteamine (CYS) were supplemented in in vitro maturation medium and embryo culture medium, cell apoptosis of embryo under different treatment conditions were detected using TUNEL fluorescence method. The purpose of this study is to improve bovine oocyte maturation and embryo development. The results are as follows: In experiment one, cell apoptosis of bovine in vitro fertilized embryo at different developmental stages were detected. The results showed that apoptosis signal first appeared in the 16cell stage, and apoptosis rates was increased with embryo development. The apoptosis rate was 26% in 16cell embryo, 83% in morula , 97% in blastocysts and 100% in expanded blastocysts and hatching blastocysts. In blastocysts stage, cell apoptosis index were increased with embryo development(apoptosis index was in blastocysts, in expanded blastocysts, in hatched blastocysts ) In experiment two, the effects of EGF or CYS on bovine oocytes maturation were pared. The results showed that 50ng/ml EGF added in maturation medium could improve oocytes maturation which increased the cleavage rate of oocyte significantly. CYS supplemented in maturation medium did n