【正文】 l apoptosis in bovine IVF embryo during different developmental stages 凋亡發(fā)生與否 凋亡率 2細(xì)胞 0 4細(xì)胞 0 8細(xì)胞 0 16細(xì)胞 + 26% 桑葚胚 + 83% 囊胚 + 97% 擴(kuò)展囊胚 + 100% 孵化囊胚 + 100% 表 2 牛胚胎不同發(fā)育階段囊胚細(xì)胞凋亡情況比較 Compare of apoptosis index in blastocysts of different developmental stages 細(xì)胞總數(shù) 內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞 滋養(yǎng)層細(xì)胞 凋亡指數(shù)（ AI） 7d 囊胚 133 36 97 8d 囊胚 134 35 99 由表 1 得出，本實(shí)驗(yàn)條件下，牛體外受精胚胎在 16細(xì)胞以后出現(xiàn)細(xì)胞凋亡現(xiàn) 象，隨發(fā)育進(jìn)程胚胎細(xì)胞凋亡率不斷提高。 16 細(xì)胞凋亡率為 26%，桑椹胚凋亡率為 83%，囊胚為 97%，擴(kuò)展囊胚和孵化囊胚凋亡率為 100% 由表 2 得出， 7d 囊胚細(xì)胞凋亡指數(shù)比 8d 囊胚細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著低，實(shí)驗(yàn)中觀 察到發(fā)育速度快胚胎形態(tài)和發(fā)育能力都比發(fā)育 速度慢胚胎好。 14 細(xì)胞因子對(duì)牛體外受精胚胎細(xì)胞凋亡的影響 試驗(yàn)二 不同濃度 EGF 或 CYS 對(duì)牛卵母細(xì)胞成熟的影響 根據(jù)試驗(yàn)一的結(jié)果，胚胎全部培養(yǎng)到第八天，經(jīng)過固定，通透，抽樣做了 TUNEL 染色，激光共聚焦觀察分析細(xì)胞凋亡。 表 3 不同濃度 EGF 或 CYS 對(duì)牛卵母細(xì)胞成熟的影響 Effect of different concentrations of EGF or CYS on bovine oocytes maturation 添加因子 濃度 卵母細(xì)胞數(shù) 卵裂數(shù)（ %） 囊胚數(shù)（ %） 凋亡指數(shù)（ AI） 對(duì)照組 240 188（ ） b 54（ ） c EGF 50 240 208（ ） a 83()a （ ng/ml） 100 240 190（ ） b 59()c CYS 100 240 193（ ） b 70()b (uM) 200 250 189（ ） b 55()c 注 ： 卵裂率 =卵裂數(shù)除以卵母細(xì)胞總數(shù)；囊胚率 =囊胚數(shù)除以卵裂數(shù)；同列數(shù)據(jù)后面標(biāo)注的不同小寫字母表示 差異顯著（ P＜ ），相同的小寫字母表示差異不顯著（ P） 由表得出， 50ng/ml 濃度 EGF 對(duì)卵母細(xì)胞的卵裂率提高顯著（ %和 %， P），從而對(duì)囊胚率有顯著影響，凋亡指數(shù)顯著低于對(duì)照組（ 和 ， P）。說(shuō)明 EGF 對(duì)卵母細(xì)胞成熟有促進(jìn)作用，此作用影響以后的發(fā)育。 100uM 濃 度的 CYS 對(duì)卵母細(xì)胞卵裂率 沒有顯著影響，但隨后的胚胎囊胚率有顯著的提高 （ %和 %,P），說(shuō)明 CYS 對(duì)卵母細(xì)胞的成熟有一定促進(jìn)作用，只是在 囊胚階段表現(xiàn)出來(lái)。 50ng/ml 濃度 EGF 和 100uM 濃度 CYS 處理組凋亡指數(shù)顯著低于 對(duì)照組(, 和 ， P)，說(shuō)明成熟液添加適當(dāng)濃度 EGF 或 CYS 能 夠顯著降低胚胎細(xì)胞凋亡。 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文 15 試驗(yàn)三 不同濃度 EGF 或 CYS 對(duì)牛體外受精胚胎發(fā)育的影響 根據(jù)試驗(yàn)一的結(jié)果，胚胎全部培養(yǎng)到第八天，經(jīng)過固定，通透，抽樣做了 TUNEL 染色，激光共聚焦觀察分析細(xì)胞凋亡。此試驗(yàn)只在發(fā)育液添加不同濃度 EGF 或 CYS。 表 4 不同濃度 EGF 或 CYS 對(duì)牛體外受精胚胎發(fā)育的影響 Effect of different concentrations of EGF or CYS on bovine IVF embryo development 添加因子濃度 卵母細(xì)胞 卵裂數(shù)（ %） 囊胚數(shù)（ %） 凋亡指數(shù)（ AI） 對(duì)照組 230 185（ ） a 54（ ） b EGF（ ng/ml） 50 230 186（ ） a 57（ ） b 100 230 182（ ） a 53（ ） b CYS(uM) 100 230 187（ ） a 71（ ） a 200 230 181（ ） a 52（ ） b 注： 卵裂率 =卵裂數(shù)除以卵母細(xì)胞總數(shù)；囊胚率 =囊 胚數(shù)除以卵裂數(shù)；同列數(shù)據(jù)后面標(biāo)注的不同小寫字母表示差 異顯著（ P＜ ），相同的小寫字母表示差異不顯著（ P） 由表得出， EGF 對(duì)胚胎囊胚率沒有影響。 100uM 濃度的 CYS 對(duì)胚胎囊胚率有顯著 提高作用（ % 和 %,P），而且其凋亡指數(shù)顯著低于其他組 ( v. ,)。說(shuō)明 CYS 對(duì)胚胎囊胚率有明顯促進(jìn)作用，能夠顯著降 低胚胎細(xì)胞凋亡。 試驗(yàn)四 EGF 和 CYS 對(duì)牛卵母細(xì)胞成熟和體外受精胚胎發(fā)育發(fā)育的 影響 根據(jù)試驗(yàn)二和試驗(yàn)三的結(jié)果，選取 EGF 的有效濃度 50ng/ml 和 CYS 的有效濃度 100uM,分別在卵母細(xì)胞成熟液和胚胎發(fā)育液都添加。 組一，成熟液添加 EGF（ 50ng/ml） +CYS（ 100uM），發(fā)育液添加 CYS（ 100uM） 組二，成熟液添加 EGF（ 50ng/ml），發(fā)育液均添加 CYS（ 100uM） 組三，發(fā)育液添加 CYS（ 100uM） 表 5 EGF 和 CYS 對(duì)牛卵母細(xì)胞成熟和體外受精胚胎發(fā)育的影響 Effect of EGF and CYS in bovine oocytes maturation and IVF embryo development M199 CR1 卵母細(xì)胞 卵裂數(shù)（ %） 囊胚數(shù)（ %） 凋亡指數(shù)（ AI） 對(duì)照組 180 141（ ） b41（ ） c E+ C+ C+ 180 158（ ） a64（ ） a E+ C C+ 180 159（ ） a 66（ ） a E C C+ 180 144（ ） b 52（ ） b 注： 同列數(shù)據(jù)后面標(biāo)注的不同小寫字母表示差異顯著（ P＜ ），相同的小寫字母表示差異不顯著（ P）； E 表示 EGF， C 表示 CYS， +表示添加， 表示沒添加 16 細(xì)胞因子對(duì)牛體外受精胚胎細(xì)胞凋亡的影響 由表得出，成熟液添加 EGF（ 50ng/ml） ,同時(shí)在發(fā)育液添加 CYS（ 100uM），可以 提高牛卵母細(xì)胞受精后的卵裂率和囊胚率，這進(jìn)一步說(shuō)明 EGF 對(duì)成熟有促進(jìn)作用。 CYS 對(duì)牛體外受精胚胎的發(fā)育有明顯的 促進(jìn)作用，囊胚發(fā)育率明顯高于對(duì)照組的 （ %和 %， P）。成熟液加 EGF，發(fā)育液加 CYS 時(shí)對(duì)胚胎囊胚率產(chǎn)生了非 常顯著的促進(jìn)作用 (%,%和 %,P),且這兩組凋亡指數(shù)也顯著低于 對(duì)照組（ , 和 ， P0,05），說(shuō)明添加 EGF 和 CYS 能夠顯著改善胚胎 發(fā)育質(zhì)量。但 EGF 和 CYS 同時(shí)添加對(duì)牛胚胎的發(fā)育并沒有產(chǎn)生疊加效應(yīng)。 討論 本實(shí)驗(yàn)的目的是在牛卵母細(xì)胞成熟液和胚胎發(fā)育培養(yǎng)液中添加不同細(xì)胞因子， 從卵裂率，囊胚率，囊胚細(xì)胞凋亡指數(shù)等參數(shù)來(lái)分析，細(xì)胞因子 EGF 和 CYS 對(duì)卵母 細(xì)胞成熟和胚胎發(fā)育的影響。 胚胎各階段凋亡現(xiàn)象 很多研究顯示，體外發(fā)育胚胎的細(xì)胞凋亡發(fā)生時(shí)間比體內(nèi)發(fā)育胚胎早，而且細(xì) 胞凋亡指數(shù)也高，這可能與體外發(fā)育胚胎所處環(huán)境有關(guān)。體外發(fā)育跟體內(nèi)發(fā)育相比， 發(fā)育不同階段缺少關(guān)鍵生長(zhǎng)因子等導(dǎo)致發(fā)育質(zhì)量受影響。當(dāng)胚胎中某些細(xì)胞的發(fā)育 受到影響，不利于整個(gè)胚胎的發(fā)育時(shí)，這些細(xì)胞會(huì)啟動(dòng)凋亡相關(guān)基因，使細(xì)胞死亡。 本實(shí)驗(yàn)中胚胎最早出現(xiàn)的細(xì)胞凋亡時(shí)間是 16 細(xì)胞，有的研究顯示體外發(fā)育的 牛胚 胎， 8細(xì)胞期觀察到了細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。這種差異可能是由于不同的培養(yǎng)體系所造成 的。體外發(fā)育胚胎可通過改善培養(yǎng)環(huán)境，優(yōu)化培養(yǎng)體系來(lái)提高胚胎的質(zhì)量，推遲凋 亡出現(xiàn)的時(shí)間。本實(shí)驗(yàn)中囊胚階段，觀察到 97%的囊胚有凋亡現(xiàn)象，隨著囊胚的發(fā) 育，擴(kuò)展囊胚和孵化囊胚的凋亡率逐漸增加，達(dá)到 100%，凋亡指數(shù)也隨之提高。 EGF 對(duì)卵母細(xì)胞成熟及胚胎發(fā)育的影響 有報(bào)道表明低濃度的 EGF（ 1,5,25ng/ml）對(duì)牛胚胎早期發(fā)育沒有顯著影響 [31]， 在本研究中比較了兩個(gè)較高濃度 EGF（ 50,100ng/ml）對(duì)牛卵母細(xì)胞成熟和胚胎發(fā)育 的影響。結(jié)果表明， 50ng/ml 的 EGF 對(duì)牛卵母細(xì)胞的成熟有顯著促進(jìn)作用，而對(duì)胚 胎發(fā)育沒有直接影響。 在本研究中，在成熟液中添加 EGF 顯著提高了牛卵母細(xì)胞成熟受精后的卵裂率 和囊胚率，這與 Guler 和 GrazulBilska 等的研究結(jié)果一致。他們的研究結(jié)果顯示， EGF 對(duì)來(lái)源于 FSH 處理過的成年母羊的卵母細(xì)胞成熟率及囊胚率均有顯著提高作用。 但是 EGF 對(duì)來(lái)源于羔羊的卵母細(xì)胞，只對(duì)其成熟有促進(jìn)作用，而對(duì)囊胚率卻沒有影 響。在山羊，卵母細(xì)胞來(lái)源 于羔羊時(shí)，用 EGF 單獨(dú)或與 CYS 共處理卵母細(xì)胞，對(duì)成 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文 17 熟沒有顯著影響；而對(duì)來(lái)源于成年母羊的卵母細(xì)胞，存活率顯著提高。在成年母牛 和小牛，成熟液添加 EGF 顯著提高卵母細(xì)胞卵裂率和囊胚率。在成年母豬，關(guān)于 EGF 對(duì)細(xì)胞核成熟和卵裂率有不同報(bào)道，但對(duì)囊胚發(fā)育有促進(jìn)作用是明確的。 這種差異現(xiàn)象可能跟卵母細(xì)胞的供體卵泡環(huán)境有關(guān) [32]。當(dāng)用 EGF 處理來(lái)源于小 卵泡的牛 COCS 時(shí)候，對(duì)卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的進(jìn)程有促進(jìn)作用，但對(duì)隨后的胚胎發(fā)育 能力 沒有影響。 EGF 在小卵泡中的濃度比大卵泡的濃度高，卵丘細(xì)胞能介導(dǎo) EGF 的 影響，卵丘細(xì)胞數(shù)較少的羔羊與成年羊相比，生長(zhǎng)因子的正常作用受到限制。很多 研究顯示 [33,34]，生長(zhǎng)因子調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞成熟的主要原因是通過卵丘細(xì)胞發(fā)揮作用。 EGF 促進(jìn)卵母細(xì)胞減數(shù)分裂恢復(fù)和極體的形成，促進(jìn)卵丘細(xì)胞的擴(kuò)展。 EGF 對(duì)受精后 4細(xì)胞期胚胎的發(fā)育沒有影響 [31]，對(duì)囊胚發(fā)育上也沒有顯著效果。 EGF 的受體超家族之一的 erbB3 的轉(zhuǎn)錄因子，在胚胎 2細(xì)胞階段存在，而 4到 16 細(xì)胞階段不存 在，但在囊胚階段重新被檢測(cè)到。 EGF 似乎在胚胎細(xì)胞分化上行使的 作用比對(duì)細(xì)胞增殖的作用更明顯 [35,36,37,38,39]。 CYS 對(duì)卵母細(xì)胞成熟及胚胎發(fā)育的影響 在本研究中，添加 100uM CYS 對(duì)卵母細(xì)胞的成熟有一定促進(jìn)作用，但是卵裂率 上沒有顯著表現(xiàn)出來(lái)，而在囊胚率上表現(xiàn)為提高效應(yīng)。 200uM CYS 在本實(shí)驗(yàn)中對(duì)卵 母細(xì)胞成熟和胚胎發(fā)育均沒有顯著影響。 CYS 在卵母細(xì)胞成熟液和胚胎發(fā)育液均添加的時(shí)候，有顯著的促進(jìn)成熟和發(fā)育 的作用，而且顯著降低胚胎細(xì)胞凋亡指數(shù)。很多研究顯 示 [32,33]， CYS 能夠增加牛和綿 羊的卵母細(xì)胞質(zhì)內(nèi) GSH 的水平，從而對(duì)胚胎發(fā)育有促進(jìn)作用。卵母細(xì)胞來(lái)自成年母 山羊時(shí)，成熟液添加 200uM 的 CYS 能促進(jìn)囊胚的發(fā)育，但 100200uM CYS 濃度對(duì)性 成熟前的山羊體外發(fā)育卵裂率和囊胚發(fā)育率沒有顯著影響。 De Matos [35]等研究發(fā)現(xiàn)， 卵母細(xì)胞來(lái)自成年小鼠時(shí)，胚胎發(fā)育中， CYS 能促進(jìn)囊胚發(fā)育，但卵母細(xì)胞來(lái)自性 成熟前小鼠時(shí)沒有顯著作用。這些發(fā)現(xiàn)顯示， CYS 對(duì)卵母細(xì)胞成熟和胚胎發(fā)育的影 響，均與卵母細(xì)胞的供體物種和成熟狀態(tài)有 關(guān)。沒有卵丘細(xì)胞團(tuán)的卵母細(xì)胞， CYS 能夠增加細(xì)胞質(zhì)內(nèi) GSH 的濃度，所以 CYS 對(duì)卵丘細(xì)胞層較少的卵母細(xì)胞有促進(jìn)成熟 的作用。 CYS 在成熟液添加，對(duì)卵裂和囊胚沒有顯著作用而能夠促進(jìn)孵化率的作用 機(jī)制目前還有待繼續(xù)研究。 CYS 在 體 外 培 養(yǎng) 體 系 中 的 促 發(fā) 育 作 用 主 要 是 通 過 GSH 實(shí) 現(xiàn) 的 [40,41,42] 。 GSH （ glutathione）是谷胱甘肽的縮寫。 GSH 是由三個(gè)氨基酸組成的短肽，細(xì)胞內(nèi)促進(jìn) 糖，脂肪，蛋白質(zhì)的代謝。 CYS 是 GSH 的 前體，低分子量硫醇（ thiol）合成半胱胺 （ cysteamine CYS）能減少胱氨酸（ cystine）形成半胱氨酸（ cysteine）的幾率， 從而在卵母細(xì)胞成熟液添加 CYS 能增加 GSH 的合成。胱氨酸的攝入對(duì)培養(yǎng)條件下細(xì) 18 細(xì)胞因子對(duì)牛體外受精胚胎細(xì)胞凋亡的影響 胞內(nèi)保持 GSH 的水平很關(guān)鍵 ， 為 GSH 的合成提供半胱氨酸。 GSH 的合成通過 γ谷氨 酰循環(huán) （ γglut