【正文】 l apoptosis in bovine IVF embryo during different developmental stages 凋亡發(fā)生與否 凋亡率 2細胞 0 4細胞 0 8細胞 0 16細胞 + 26% 桑葚胚 + 83% 囊胚 + 97% 擴展囊胚 + 100% 孵化囊胚 + 100% 表 2 牛胚胎不同發(fā)育階段囊胚細胞凋亡情況比較 Compare of apoptosis index in blastocysts of different developmental stages 細胞總數(shù) 內(nèi)細胞團細胞 滋養(yǎng)層細胞 凋亡指數(shù)（ AI） 7d 囊胚 133 36 97 8d 囊胚 134 35 99 由表 1 得出，本實驗條件下，牛體外受精胚胎在 16細胞以后出現(xiàn)細胞凋亡現(xiàn) 象，隨發(fā)育進程胚胎細胞凋亡率不斷提高。 16 細胞凋亡率為 26%，桑椹胚凋亡率為 83%，囊胚為 97%，擴展囊胚和孵化囊胚凋亡率為 100% 由表 2 得出， 7d 囊胚細胞凋亡指數(shù)比 8d 囊胚細胞凋亡指數(shù)顯著低，實驗中觀 察到發(fā)育速度快胚胎形態(tài)和發(fā)育能力都比發(fā)育 速度慢胚胎好。 14 細胞因子對牛體外受精胚胎細胞凋亡的影響 試驗二 不同濃度 EGF 或 CYS 對牛卵母細胞成熟的影響 根據(jù)試驗一的結果，胚胎全部培養(yǎng)到第八天，經(jīng)過固定，通透，抽樣做了 TUNEL 染色，激光共聚焦觀察分析細胞凋亡。 表 3 不同濃度 EGF 或 CYS 對牛卵母細胞成熟的影響 Effect of different concentrations of EGF or CYS on bovine oocytes maturation 添加因子 濃度 卵母細胞數(shù) 卵裂數(shù)（ %） 囊胚數(shù)（ %） 凋亡指數(shù)（ AI） 對照組 240 188（ ） b 54（ ） c EGF 50 240 208（ ） a 83()a （ ng/ml） 100 240 190（ ） b 59()c CYS 100 240 193（ ） b 70()b (uM) 200 250 189（ ） b 55()c 注 ： 卵裂率 =卵裂數(shù)除以卵母細胞總數(shù)；囊胚率 =囊胚數(shù)除以卵裂數(shù)；同列數(shù)據(jù)后面標注的不同小寫字母表示 差異顯著（ P＜ ），相同的小寫字母表示差異不顯著（ P） 由表得出， 50ng/ml 濃度 EGF 對卵母細胞的卵裂率提高顯著（ %和 %， P），從而對囊胚率有顯著影響，凋亡指數(shù)顯著低于對照組（ 和 ， P）。說明 EGF 對卵母細胞成熟有促進作用，此作用影響以后的發(fā)育。 100uM 濃 度的 CYS 對卵母細胞卵裂率 沒有顯著影響，但隨后的胚胎囊胚率有顯著的提高 （ %和 %,P），說明 CYS 對卵母細胞的成熟有一定促進作用，只是在 囊胚階段表現(xiàn)出來。 50ng/ml 濃度 EGF 和 100uM 濃度 CYS 處理組凋亡指數(shù)顯著低于 對照組(, 和 ， P)，說明成熟液添加適當濃度 EGF 或 CYS 能 夠顯著降低胚胎細胞凋亡。 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學碩士學位論文 15 試驗三 不同濃度 EGF 或 CYS 對牛體外受精胚胎發(fā)育的影響 根據(jù)試驗一的結果，胚胎全部培養(yǎng)到第八天，經(jīng)過固定，通透，抽樣做了 TUNEL 染色，激光共聚焦觀察分析細胞凋亡。此試驗只在發(fā)育液添加不同濃度 EGF 或 CYS。 表 4 不同濃度 EGF 或 CYS 對牛體外受精胚胎發(fā)育的影響 Effect of different concentrations of EGF or CYS on bovine IVF embryo development 添加因子濃度 卵母細胞 卵裂數(shù)（ %） 囊胚數(shù)（ %） 凋亡指數(shù)（ AI） 對照組 230 185（ ） a 54（ ） b EGF（ ng/ml） 50 230 186（ ） a 57（ ） b 100 230 182（ ） a 53（ ） b CYS(uM) 100 230 187（ ） a 71（ ） a 200 230 181（ ） a 52（ ） b 注： 卵裂率 =卵裂數(shù)除以卵母細胞總數(shù)；囊胚率 =囊 胚數(shù)除以卵裂數(shù)；同列數(shù)據(jù)后面標注的不同小寫字母表示差 異顯著（ P＜ ），相同的小寫字母表示差異不顯著（ P） 由表得出， EGF 對胚胎囊胚率沒有影響。 100uM 濃度的 CYS 對胚胎囊胚率有顯著 提高作用（ % 和 %,P），而且其凋亡指數(shù)顯著低于其他組 ( v. ,)。說明 CYS 對胚胎囊胚率有明顯促進作用，能夠顯著降 低胚胎細胞凋亡。 試驗四 EGF 和 CYS 對牛卵母細胞成熟和體外受精胚胎發(fā)育發(fā)育的 影響 根據(jù)試驗二和試驗三的結果，選取 EGF 的有效濃度 50ng/ml 和 CYS 的有效濃度 100uM,分別在卵母細胞成熟液和胚胎發(fā)育液都添加。 組一，成熟液添加 EGF（ 50ng/ml） +CYS（ 100uM），發(fā)育液添加 CYS（ 100uM） 組二，成熟液添加 EGF（ 50ng/ml），發(fā)育液均添加 CYS（ 100uM） 組三，發(fā)育液添加 CYS（ 100uM） 表 5 EGF 和 CYS 對牛卵母細胞成熟和體外受精胚胎發(fā)育的影響 Effect of EGF and CYS in bovine oocytes maturation and IVF embryo development M199 CR1 卵母細胞 卵裂數(shù)（ %） 囊胚數(shù)（ %） 凋亡指數(shù)（ AI） 對照組 180 141（ ） b41（ ） c E+ C+ C+ 180 158（ ） a64（ ） a E+ C C+ 180 159（ ） a 66（ ） a E C C+ 180 144（ ） b 52（ ） b 注： 同列數(shù)據(jù)后面標注的不同小寫字母表示差異顯著（ P＜ ），相同的小寫字母表示差異不顯著（ P）； E 表示 EGF， C 表示 CYS， +表示添加， 表示沒添加 16 細胞因子對牛體外受精胚胎細胞凋亡的影響 由表得出，成熟液添加 EGF（ 50ng/ml） ,同時在發(fā)育液添加 CYS（ 100uM），可以 提高牛卵母細胞受精后的卵裂率和囊胚率，這進一步說明 EGF 對成熟有促進作用。 CYS 對牛體外受精胚胎的發(fā)育有明顯的 促進作用，囊胚發(fā)育率明顯高于對照組的 （ %和 %， P）。成熟液加 EGF，發(fā)育液加 CYS 時對胚胎囊胚率產(chǎn)生了非 常顯著的促進作用 (%,%和 %,P),且這兩組凋亡指數(shù)也顯著低于 對照組（ , 和 ， P0,05），說明添加 EGF 和 CYS 能夠顯著改善胚胎 發(fā)育質量。但 EGF 和 CYS 同時添加對牛胚胎的發(fā)育并沒有產(chǎn)生疊加效應。 討論 本實驗的目的是在牛卵母細胞成熟液和胚胎發(fā)育培養(yǎng)液中添加不同細胞因子， 從卵裂率，囊胚率，囊胚細胞凋亡指數(shù)等參數(shù)來分析，細胞因子 EGF 和 CYS 對卵母 細胞成熟和胚胎發(fā)育的影響。 胚胎各階段凋亡現(xiàn)象 很多研究顯示，體外發(fā)育胚胎的細胞凋亡發(fā)生時間比體內(nèi)發(fā)育胚胎早，而且細 胞凋亡指數(shù)也高，這可能與體外發(fā)育胚胎所處環(huán)境有關。體外發(fā)育跟體內(nèi)發(fā)育相比， 發(fā)育不同階段缺少關鍵生長因子等導致發(fā)育質量受影響。當胚胎中某些細胞的發(fā)育 受到影響，不利于整個胚胎的發(fā)育時，這些細胞會啟動凋亡相關基因，使細胞死亡。 本實驗中胚胎最早出現(xiàn)的細胞凋亡時間是 16 細胞，有的研究顯示體外發(fā)育的 牛胚 胎， 8細胞期觀察到了細胞凋亡現(xiàn)象。這種差異可能是由于不同的培養(yǎng)體系所造成 的。體外發(fā)育胚胎可通過改善培養(yǎng)環(huán)境，優(yōu)化培養(yǎng)體系來提高胚胎的質量，推遲凋 亡出現(xiàn)的時間。本實驗中囊胚階段，觀察到 97%的囊胚有凋亡現(xiàn)象，隨著囊胚的發(fā) 育，擴展囊胚和孵化囊胚的凋亡率逐漸增加，達到 100%，凋亡指數(shù)也隨之提高。 EGF 對卵母細胞成熟及胚胎發(fā)育的影響 有報道表明低濃度的 EGF（ 1,5,25ng/ml）對牛胚胎早期發(fā)育沒有顯著影響 [31]， 在本研究中比較了兩個較高濃度 EGF（ 50,100ng/ml）對牛卵母細胞成熟和胚胎發(fā)育 的影響。結果表明， 50ng/ml 的 EGF 對牛卵母細胞的成熟有顯著促進作用，而對胚 胎發(fā)育沒有直接影響。 在本研究中，在成熟液中添加 EGF 顯著提高了牛卵母細胞成熟受精后的卵裂率 和囊胚率，這與 Guler 和 GrazulBilska 等的研究結果一致。他們的研究結果顯示， EGF 對來源于 FSH 處理過的成年母羊的卵母細胞成熟率及囊胚率均有顯著提高作用。 但是 EGF 對來源于羔羊的卵母細胞，只對其成熟有促進作用，而對囊胚率卻沒有影 響。在山羊，卵母細胞來源 于羔羊時，用 EGF 單獨或與 CYS 共處理卵母細胞，對成 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學碩士學位論文 17 熟沒有顯著影響；而對來源于成年母羊的卵母細胞，存活率顯著提高。在成年母牛 和小牛，成熟液添加 EGF 顯著提高卵母細胞卵裂率和囊胚率。在成年母豬，關于 EGF 對細胞核成熟和卵裂率有不同報道，但對囊胚發(fā)育有促進作用是明確的。 這種差異現(xiàn)象可能跟卵母細胞的供體卵泡環(huán)境有關 [32]。當用 EGF 處理來源于小 卵泡的牛 COCS 時候，對卵母細胞減數(shù)分裂的進程有促進作用，但對隨后的胚胎發(fā)育 能力 沒有影響。 EGF 在小卵泡中的濃度比大卵泡的濃度高，卵丘細胞能介導 EGF 的 影響，卵丘細胞數(shù)較少的羔羊與成年羊相比，生長因子的正常作用受到限制。很多 研究顯示 [33,34]，生長因子調節(jié)卵母細胞成熟的主要原因是通過卵丘細胞發(fā)揮作用。 EGF 促進卵母細胞減數(shù)分裂恢復和極體的形成，促進卵丘細胞的擴展。 EGF 對受精后 4細胞期胚胎的發(fā)育沒有影響 [31]，對囊胚發(fā)育上也沒有顯著效果。 EGF 的受體超家族之一的 erbB3 的轉錄因子，在胚胎 2細胞階段存在，而 4到 16 細胞階段不存 在，但在囊胚階段重新被檢測到。 EGF 似乎在胚胎細胞分化上行使的 作用比對細胞增殖的作用更明顯 [35,36,37,38,39]。 CYS 對卵母細胞成熟及胚胎發(fā)育的影響 在本研究中，添加 100uM CYS 對卵母細胞的成熟有一定促進作用，但是卵裂率 上沒有顯著表現(xiàn)出來，而在囊胚率上表現(xiàn)為提高效應。 200uM CYS 在本實驗中對卵 母細胞成熟和胚胎發(fā)育均沒有顯著影響。 CYS 在卵母細胞成熟液和胚胎發(fā)育液均添加的時候，有顯著的促進成熟和發(fā)育 的作用，而且顯著降低胚胎細胞凋亡指數(shù)。很多研究顯 示 [32,33]， CYS 能夠增加牛和綿 羊的卵母細胞質內(nèi) GSH 的水平，從而對胚胎發(fā)育有促進作用。卵母細胞來自成年母 山羊時，成熟液添加 200uM 的 CYS 能促進囊胚的發(fā)育，但 100200uM CYS 濃度對性 成熟前的山羊體外發(fā)育卵裂率和囊胚發(fā)育率沒有顯著影響。 De Matos [35]等研究發(fā)現(xiàn)， 卵母細胞來自成年小鼠時，胚胎發(fā)育中， CYS 能促進囊胚發(fā)育，但卵母細胞來自性 成熟前小鼠時沒有顯著作用。這些發(fā)現(xiàn)顯示， CYS 對卵母細胞成熟和胚胎發(fā)育的影 響，均與卵母細胞的供體物種和成熟狀態(tài)有 關。沒有卵丘細胞團的卵母細胞， CYS 能夠增加細胞質內(nèi) GSH 的濃度，所以 CYS 對卵丘細胞層較少的卵母細胞有促進成熟 的作用。 CYS 在成熟液添加，對卵裂和囊胚沒有顯著作用而能夠促進孵化率的作用 機制目前還有待繼續(xù)研究。 CYS 在 體 外 培 養(yǎng) 體 系 中 的 促 發(fā) 育 作 用 主 要 是 通 過 GSH 實 現(xiàn) 的 [40,41,42] 。 GSH （ glutathione）是谷胱甘肽的縮寫。 GSH 是由三個氨基酸組成的短肽，細胞內(nèi)促進 糖，脂肪，蛋白質的代謝。 CYS 是 GSH 的 前體，低分子量硫醇（ thiol）合成半胱胺 （ cysteamine CYS）能減少胱氨酸（ cystine）形成半胱氨酸（ cysteine）的幾率， 從而在卵母細胞成熟液添加 CYS 能增加 GSH 的合成。胱氨酸的攝入對培養(yǎng)條件下細 18 細胞因子對牛體外受精胚胎細胞凋亡的影響 胞內(nèi)保持 GSH 的水平很關鍵 ， 為 GSH 的合成提供半胱氨酸。 GSH 的合成通過 γ谷氨 酰循環(huán) （ γglut