【文章內容簡介】 mbo, Bak, Bad, Bok, Bik, Bid, Bim/Bod, Bik/Nbk, Hrk, Bmf, Nix, PUMA, Noxa, BNip3） 等?？沟蛲雠c其他抗凋亡成員間 ， 促凋亡和其 他促凋亡成員間 ， 還有抗凋亡和促凋亡成員間能夠隨意地互相作用 ， 形成二聚體或多聚體。當大部分 成員間隨意作用時 ， 死亡促進因子和死亡抑制因子間的有些相互作用是可能高度專 一的 （ 比如 Bok 與 Mcl1 間 ） 。促凋亡成員按結構也可分為多結構域蛋白和 BH3 單結 構域蛋白。除了 BH3 特有結構域促凋亡成員外其他成員間的相互作用的意義還沒有 確定。有人發(fā)現(xiàn) [23]， 凋亡的誘導不依賴于 P53 抑制劑 ， 而是依賴于 Bak 或者 Bax。 此外 ， 當凋亡發(fā)生時 BH3 單結構域蛋白 Bim 水平提高 ， 而 Mcl1 和 Bik 水平保持不 變。 Daniel 等 [24]認為 Mcl1 的轉移是由泛蛋白酶介導的 ， 細胞應對不利因素時做出 的應激反應 ， 其結果是能夠誘導并促進細胞凋亡。 Antonsson 發(fā)現(xiàn) [25]， 抗凋亡和促凋亡多結構域蛋白相互作用 ， 在體外人工脂質 體膜上可形成通道?？沟蛲龅鞍字挥性诘? PH（ PH 低于 ） 條件下形成通道的活動 ， 這表示在生理條件下也可能存在形成通道的活動。脂質體的研究中顯示 ， Bclxl 能 4 細胞因子對牛體外受精胚胎細胞凋亡的影響 刺激 VDAC 的關閉，而 Bax 和 Bak 能促進其開啟，這可能使細胞色素 C 的通過。然而， 此通道在其開啟狀態(tài)下也不夠大到能讓細胞色素 C 通過。 Bax 和 Bak 需要結合到 VDAC 并使其形成一個巨大通道才能釋放細胞色素 C。 由上可見 ,Bax 對于細胞色素 C 的釋放起著關鍵的作用，在凋亡信號的刺激下 Bax 可從胞質轉位到線粒體膜上 ,從而啟動線粒體介導的細胞凋亡?？沟蛲鲱? Bcl2 蛋白可以通過阻止促凋亡蛋白在線粒體膜上形成低聚體來發(fā)揮其抗凋亡作用 [26]。 Yannis 等 [27]人通過對 Bcl2 家族成員的 mRNA 水平上的分析提出， BCL2L10 是 一個很重要的母源來源的 Bcl2 家族轉錄物，有抗凋亡作用。研究揭露出從卵子傳 遞到合子的一種進化上保守的途徑。他們證明 BCL2L10 與微管蛋白結合，卵胞質周 圍參與時間特異性重新分配，直接調控腫瘤蛋白和線粒體。在死亡的卵母細胞， BCL2L10 與促凋亡 BAX 共定位，并且中和 BCL2L10 會加速卵母細胞死亡。他們提出， BCL2L10 是與卵母細胞成熟、受精和胚胎發(fā)育存活能力相關的重要的新的候選因子。 胚胎的細胞凋亡 根據研究，體外培養(yǎng)的胚胎與體內培養(yǎng)的胚胎相比，細胞發(fā)生凋亡的時間更早， 且凋亡數量更多。體外培養(yǎng)環(huán)境中存在不利于胚胎發(fā)育的物理化學因素刺激或者培 養(yǎng)液缺乏胚胎所需的一些重要細胞因子或激素都是造成此現(xiàn)象的原因。動物受精后 胚胎基因組并不是立即轉錄表達的，而是先表達母源基因組，再表達胚胎基因組。 胚胎基因組激活（ embryonic genome activation,EGA）的開始時間在不同物種是不 一樣的。如在小鼠， 2細胞階段以后；在人和豬， 48 細胞階段以后；在牛， 816 細胞階段以后 ,而且體內發(fā)育 條件下細胞凋亡是 EGA 之后發(fā)生的。在物理化學或者人 為誘導的情況下，凋亡發(fā)生的時間可在 EGA 之前。 細胞凋亡檢測方法 形態(tài)學檢測 形態(tài)學檢測是依據細胞凋亡過程中所表現(xiàn)出來的一些形態(tài)學特征來判定凋亡。 細胞凋亡的形態(tài)學特征為細胞收縮變圓，與鄰接細胞脫離，失去微絨毛，胞漿濃縮， 核染色質固縮，聚集在核膜下，呈邊界分明的顆粒狀或新月形小體，進而核裂解成 質膜包繞的碎片，胞膜突出形成質膜小泡，脫落后形成細胞凋亡小體 (apoptosis body)。這種死亡過程不發(fā)生溶酶體、線粒體及細胞膜破裂，沒 有細胞內涵物外泄， 故不引起炎癥反應。凋亡小體很快被噬細胞或鄰接細胞所吞噬。一般認為，凋亡小 體幾分鐘即可形成，被吞噬的凋亡小體可在細胞內存留數小時 [28]。但卵母細胞是身 體中最大的細胞，所以其凋亡的形態(tài)學特征無法按照體細胞凋亡的形態(tài)學標準來評 判。目前一般都通過生化檢測方法來判斷。 內蒙古農業(yè)大學碩士學位論文 5 生化檢測 細胞凋亡的生化特征最主要是 DNA 核小體間的斷裂，產 50300kb 或 180200bp 整數倍的多聚核苷酸片段，在瓊脂糖凝膠上呈梯形電泳圖譜 (DNA ladder， 1980)； 膜結構對稱性喪失，并 PS 顆粒外翻；細胞中具 Caspase3 酶的活性表達；細胞中促 凋亡基因與抗凋亡基因表達等都是重要的生化特征。以下介紹幾種常用生化檢測方 法。 磷脂酰絲氨酸外翻分析（ Annexin V）法 磷脂酰絲氨酸（ Phosphatidylserine,PS）正常位于細胞膜的內側，但在細胞凋 亡的早期 PS 可從細胞膜的內側翻轉到細胞膜的表面，暴露在細胞外環(huán)境中。 AnnexinV 是一種分子量為 35～ 36 KD 的 Ca2+依賴性磷脂結合蛋 白，能與 PS 高親和 力特異性結合。 AnnexinV 進行熒光素（ FITC、 PE）或生物素標記，以標記了的 AnnexinV 作為熒光探針利用流式細胞儀或熒光顯微鏡可檢測細胞凋亡的發(fā)生。碘 化丙啶（ Propidine iodide,PI）是一種核酸染料，它不能透過完整的細胞膜，但在 凋亡中晚期的細胞和死細胞， PI 能夠透細胞膜而使細胞核紅染。因此將 AnnexinV 與 PI 匹配使用，就可以將凋亡早晚期的細胞及死細胞區(qū)分開來。 TUNEL 法 該 方 法 稱 為 脫 氧 核 糖 核 苷 酸 末 端 轉 移 酶 介 導 的 缺 口 末 端 標 記 法 (terminaldeoxynucleotidyl transferase mediated niek end labeling， TUNEL)， 1992 年 Gavrieli 等首先報道了該方法。在細胞凋亡中，染色體 DNA 雙鏈斷裂或單 鏈斷裂而產生大量的粘性 339。OH 末端，而正常的或正在增殖的細胞幾乎沒有 DNA 的 斷裂，因而沒有 339。OH 形成。該方法可用細胞懸液、細胞涂片、載玻片上的粘連細 胞、冰凍組織或石蠟包埋組織為 檢測標本，可在脫氧核糖核苷酸末端轉移酶 (TdT) 的作用下，將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸酶或生物素形成的 衍生物標記到 DNA 的 339。OH 末端，從而進行凋亡細胞的檢測。原位 TUNEL 法快速， 其反應全過程僅需約 3 h，其靈敏度及特異性都較高，尤其適用于作有關細胞凋亡 與相關基因表達關系方面的研究。 DNA 電泳 細胞發(fā)生凋亡是內源性 NUC1 DNaseⅠ 和 DNaseⅡ 等核酸內切酶活性所致。經 這些內切酶切割使核小體間斷裂，產生大小不同的片段，但都是 180～ 200 bp 的整 數 15 倍。凋亡細胞中提取的 DNA 進行常規(guī)的瓊脂糖凝膠電泳，并用 EB 進行染色時， 這些大小不同的 DNA 片段就呈現(xiàn)出梯狀條帶 [29]。而壞死細胞 DNA 電泳后則呈模糊的 涂片狀。絕大多數凋亡細胞中 DNA 的斷裂都表現(xiàn)出這種典型特征。 6 細胞因子對牛體外受精胚胎細胞凋亡的影響 PCR 技術檢測 在細胞凋亡的機理研究中，發(fā)現(xiàn)了很多表達異常的基因，檢測這些特異基因的 表達水平也是檢測細胞凋亡的一種方法。 PCR 即是檢測這些特異性基因的常用方法。 如 LMPCR 被用來擴增凋亡細胞產生的 DNA 片段。當瓊脂糖凝膠電泳呈現(xiàn)的 DNA 梯形 條帶不明顯時，用 LMPCR 擴增后再電泳可見明顯的梯形圖譜 [30]。又如 RTPCR 被用 來檢測 Bcl2 和 Bax 基因表達水平的比例，根據其比例分析細胞是存活還是凋亡。 近年來隨著熒光定量 PCR 技術的發(fā)展，用定量 PCR 技術檢測基因表達水平更快更準 確。此外，將 PCR 技術和核酸分子雜交技術相結合，能顯著提高檢測的特異性和靈 敏度。 ELISA 法分析組蛋白 細胞發(fā)生凋亡時， Ca2+、 Mg2+依賴 性內源核酸內切酶被激活，在核小體連接區(qū)切 開雙鏈 DNA，產生帶有單個或寡聚核小體的 DNA 片段。而核小體 DNA 與中心組蛋白 H2A， H2B， H3 和 H4 緊密結合，又可以防止核酸內切酶的切割作用，故產生的 DNA 片段是 180～ 200 bp 的整數倍，并在凋亡細胞的胞漿中出現(xiàn)核小體或寡聚核小體。 該法是利用 “夾心定量酶標免疫測定法 ”的原理，用抗組蛋白－生物素和抗 DNA－ 過氧化物酶（ POD）分別結合到核小體的組蛋白和 DNA 成分上，洗滌除去未結合的抗 體后，加入 POD 底物產生顏色反 應。通過酶標測定儀分析，即可定量反映細胞凋亡 的水平。該方法的優(yōu)點是：靈敏度高、操作快捷、無放射性同位素污染。可定量測 定細胞凋亡，無需預先標記細胞，所用抗體不具有種屬特異性， POD 標記的抗 DNA 抗體可與單鏈和雙鏈的 DNA 起反應?？贵w夾心酶聯(lián)免疫分析法可以測定核小體單體 和寡聚核小體，因而可以用于許多不同的培養(yǎng)細胞株或動物組織細胞的凋亡檢測。 線粒體膜勢能的檢測 線粒體在細胞凋亡的過程中起著樞紐作用，多種細胞凋亡刺激因子均可誘導不 同的細胞發(fā)生凋亡，而線粒體跨膜電位 DYmt 的下降，被 認為是細胞凋亡級聯(lián)反應過 程中最早發(fā)生的事件，它發(fā)生在細胞核凋亡特征（染色質濃縮、 DNA 斷裂）出現(xiàn)之 前，一旦線粒體 DYmt 崩潰，則細胞凋亡不可逆轉。線粒體跨膜電位的存在，使一些 親脂性陽離子熒光染料如 Rhodamine 12 Tetrechlorotetraethylbenzimidazol carbocyanine iodide(JC1)、 Tetramethyl rhodaminemethyl ester(TMRM)等可結 合到線粒體基質，其熒光的增強或減弱說明線粒體內膜電負性的增高或降低 ，從而 判定凋亡與否。 內蒙古農業(yè)大學碩士學位論文 7 Caspase3 活性的檢測 Caspase 家族在介導細胞凋亡的過程中起著非常重要的作用，其中 Caspase3 是關鍵的執(zhí)行分子，它在凋亡信號傳導的許多途徑中發(fā)揮功能。 Caspase3 通常以 酶原（ 32 KD16）的形式存在于胞漿中，在凋亡的早期階段被激活，活化的 Caspase3 由兩個大亞基（ 17KD）和兩個小亞基（ 12 KD）組成，裂解相應的胞漿胞核底物，最 終導致細胞凋亡。但在細胞凋亡的晚期和死亡細胞， Caspase3 的活性明顯下降。 總之，檢測細胞凋亡的方法很多，但都有其自身的缺點和局限性。目前對凋亡 細胞的檢測常規(guī)采用形態(tài)學檢查和 DNA 電泳分析，更靈敏的方法可采用流式細胞儀 檢測法、 TUNEL 及 ELISA 法等。本實驗采用 TUNEL 方法和激光共聚焦顯微鏡結合的 方式檢測細胞凋亡。 胚胎細胞凋亡研究展望 在哺乳動物中，雌性生殖細胞的存活與凋亡調控是多因子參與的復雜調節(jié)過程。 大約 90%的未成熟卵母細胞能在體外達到核成熟，并有 80%能經歷受精、卵裂并發(fā)育 到 2 細胞階段，然而 發(fā)育到囊胚階段的僅達到 40%，要遠遠低于體內受精后的囊胚 發(fā)育率。采取有效檢測方法確定卵母細胞和胚胎的凋亡機制，對提高體外授精的囊 胚率有重要意義。這對家畜進行體外受精并規(guī)?；a以及瀕危動物的人工繁殖等 都非常有意義。 Coskun 和 Erickson 等的研究表明，表皮生長因子（ EGF）、胰島素樣生長因子 （ IGF）、轉移生長因子 (TGF)等生長因子都能不同程度地促進小鼠、大鼠、牛、豬、 倉鼠等卵母細胞的體外成熟。 Brucker 等的研究發(fā)現(xiàn)生長因子的作用必須通過卵丘 細胞介導，對裸卵無作用。在各 種生長因子中， EGF 在卵母細胞成熟培養(yǎng)中應用較 多， EGF 是顆粒細胞強有力的分裂素，也可能是卵母細胞成熟分裂恢復的一種信號 因子。 Coskun 等報道 EGF 能顯著提高牛成熟卵母細胞原核形成率，卵裂率及 4～ 8 細胞率。 Arellano 等的研究結果表明， EGF 能顯著提高豬卵母細胞的體外成熟率。 Merlo 等培養(yǎng)貓卵母細胞時發(fā)現(xiàn)，盡管 EGF 對卵母細胞胞核成熟沒有顯著影響，但 卻能顯著提高卵裂率和囊胚率。半胱胺（ CYS）是一種含有硫醇成分的谷胱甘肽（ GSH） 前體，能夠在卵丘 卵母細胞復合 體（ COCs）內合成 GSH 并提高其含量。據研究， CYS 能夠細胞質成熟，在體外受精中促進雄原核的形成。有些研究顯示， CYS 對卵母細