【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 mbo, Bak, Bad, Bok, Bik, Bid, Bim/Bod, Bik/Nbk, Hrk, Bmf, Nix, PUMA, Noxa, BNip3） 等。抗凋亡與其他抗凋亡成員間 ， 促凋亡和其 他促凋亡成員間 ， 還有抗凋亡和促凋亡成員間能夠隨意地互相作用 ， 形成二聚體或多聚體。當(dāng)大部分 成員間隨意作用時(shí) ， 死亡促進(jìn)因子和死亡抑制因子間的有些相互作用是可能高度專(zhuān) 一的 （ 比如 Bok 與 Mcl1 間 ） 。促凋亡成員按結(jié)構(gòu)也可分為多結(jié)構(gòu)域蛋白和 BH3 單結(jié) 構(gòu)域蛋白。除了 BH3 特有結(jié)構(gòu)域促凋亡成員外其他成員間的相互作用的意義還沒(méi)有 確定。有人發(fā)現(xiàn) [23]， 凋亡的誘導(dǎo)不依賴(lài)于 P53 抑制劑 ， 而是依賴(lài)于 Bak 或者 Bax。 此外 ， 當(dāng)?shù)蛲霭l(fā)生時(shí) BH3 單結(jié)構(gòu)域蛋白 Bim 水平提高 ， 而 Mcl1 和 Bik 水平保持不 變。 Daniel 等 [24]認(rèn)為 Mcl1 的轉(zhuǎn)移是由泛蛋白酶介導(dǎo)的 ， 細(xì)胞應(yīng)對(duì)不利因素時(shí)做出 的應(yīng)激反應(yīng) ， 其結(jié)果是能夠誘導(dǎo)并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。 Antonsson 發(fā)現(xiàn) [25]， 抗凋亡和促凋亡多結(jié)構(gòu)域蛋白相互作用 ， 在體外人工脂質(zhì) 體膜上可形成通道?？沟蛲龅鞍字挥性诘? PH（ PH 低于 ） 條件下形成通道的活動(dòng) ， 這表示在生理?xiàng)l件下也可能存在形成通道的活動(dòng)。脂質(zhì)體的研究中顯示 ， Bclxl 能 4 細(xì)胞因子對(duì)牛體外受精胚胎細(xì)胞凋亡的影響 刺激 VDAC 的關(guān)閉，而 Bax 和 Bak 能促進(jìn)其開(kāi)啟，這可能使細(xì)胞色素 C 的通過(guò)。然而， 此通道在其開(kāi)啟狀態(tài)下也不夠大到能讓細(xì)胞色素 C 通過(guò)。 Bax 和 Bak 需要結(jié)合到 VDAC 并使其形成一個(gè)巨大通道才能釋放細(xì)胞色素 C。 由上可見(jiàn) ,Bax 對(duì)于細(xì)胞色素 C 的釋放起著關(guān)鍵的作用，在凋亡信號(hào)的刺激下 Bax 可從胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到線粒體膜上 ,從而啟動(dòng)線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡?？沟蛲鲱?lèi) Bcl2 蛋白可以通過(guò)阻止促凋亡蛋白在線粒體膜上形成低聚體來(lái)發(fā)揮其抗凋亡作用 [26]。 Yannis 等 [27]人通過(guò)對(duì) Bcl2 家族成員的 mRNA 水平上的分析提出， BCL2L10 是 一個(gè)很重要的母源來(lái)源的 Bcl2 家族轉(zhuǎn)錄物，有抗凋亡作用。研究揭露出從卵子傳 遞到合子的一種進(jìn)化上保守的途徑。他們證明 BCL2L10 與微管蛋白結(jié)合，卵胞質(zhì)周 圍參與時(shí)間特異性重新分配，直接調(diào)控腫瘤蛋白和線粒體。在死亡的卵母細(xì)胞， BCL2L10 與促凋亡 BAX 共定位，并且中和 BCL2L10 會(huì)加速卵母細(xì)胞死亡。他們提出， BCL2L10 是與卵母細(xì)胞成熟、受精和胚胎發(fā)育存活能力相關(guān)的重要的新的候選因子。 胚胎的細(xì)胞凋亡 根據(jù)研究，體外培養(yǎng)的胚胎與體內(nèi)培養(yǎng)的胚胎相比，細(xì)胞發(fā)生凋亡的時(shí)間更早， 且凋亡數(shù)量更多。體外培養(yǎng)環(huán)境中存在不利于胚胎發(fā)育的物理化學(xué)因素刺激或者培 養(yǎng)液缺乏胚胎所需的一些重要細(xì)胞因子或激素都是造成此現(xiàn)象的原因。動(dòng)物受精后 胚胎基因組并不是立即轉(zhuǎn)錄表達(dá)的，而是先表達(dá)母源基因組，再表達(dá)胚胎基因組。 胚胎基因組激活（ embryonic genome activation,EGA）的開(kāi)始時(shí)間在不同物種是不 一樣的。如在小鼠， 2細(xì)胞階段以后；在人和豬， 48 細(xì)胞階段以后；在牛， 816 細(xì)胞階段以后 ,而且體內(nèi)發(fā)育 條件下細(xì)胞凋亡是 EGA 之后發(fā)生的。在物理化學(xué)或者人 為誘導(dǎo)的情況下，凋亡發(fā)生的時(shí)間可在 EGA 之前。 細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法 形態(tài)學(xué)檢測(cè) 形態(tài)學(xué)檢測(cè)是依據(jù)細(xì)胞凋亡過(guò)程中所表現(xiàn)出來(lái)的一些形態(tài)學(xué)特征來(lái)判定凋亡。 細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)特征為細(xì)胞收縮變圓，與鄰接細(xì)胞脫離，失去微絨毛，胞漿濃縮， 核染色質(zhì)固縮，聚集在核膜下，呈邊界分明的顆粒狀或新月形小體，進(jìn)而核裂解成 質(zhì)膜包繞的碎片，胞膜突出形成質(zhì)膜小泡，脫落后形成細(xì)胞凋亡小體 (apoptosis body)。這種死亡過(guò)程不發(fā)生溶酶體、線粒體及細(xì)胞膜破裂，沒(méi) 有細(xì)胞內(nèi)涵物外泄， 故不引起炎癥反應(yīng)。凋亡小體很快被噬細(xì)胞或鄰接細(xì)胞所吞噬。一般認(rèn)為，凋亡小 體幾分鐘即可形成，被吞噬的凋亡小體可在細(xì)胞內(nèi)存留數(shù)小時(shí) [28]。但卵母細(xì)胞是身 體中最大的細(xì)胞，所以其凋亡的形態(tài)學(xué)特征無(wú)法按照體細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)來(lái)評(píng) 判。目前一般都通過(guò)生化檢測(cè)方法來(lái)判斷。 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文 5 生化檢測(cè) 細(xì)胞凋亡的生化特征最主要是 DNA 核小體間的斷裂，產(chǎn) 50300kb 或 180200bp 整數(shù)倍的多聚核苷酸片段，在瓊脂糖凝膠上呈梯形電泳圖譜 (DNA ladder， 1980)； 膜結(jié)構(gòu)對(duì)稱(chēng)性喪失，并 PS 顆粒外翻；細(xì)胞中具 Caspase3 酶的活性表達(dá)；細(xì)胞中促 凋亡基因與抗凋亡基因表達(dá)等都是重要的生化特征。以下介紹幾種常用生化檢測(cè)方 法。 磷脂酰絲氨酸外翻分析（ Annexin V）法 磷脂酰絲氨酸（ Phosphatidylserine,PS）正常位于細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)，但在細(xì)胞凋 亡的早期 PS 可從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的表面，暴露在細(xì)胞外環(huán)境中。 AnnexinV 是一種分子量為 35～ 36 KD 的 Ca2+依賴(lài)性磷脂結(jié)合蛋 白，能與 PS 高親和 力特異性結(jié)合。 AnnexinV 進(jìn)行熒光素（ FITC、 PE）或生物素標(biāo)記，以標(biāo)記了的 AnnexinV 作為熒光探針利用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡可檢測(cè)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。碘 化丙啶（ Propidine iodide,PI）是一種核酸染料，它不能透過(guò)完整的細(xì)胞膜，但在 凋亡中晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞， PI 能夠透細(xì)胞膜而使細(xì)胞核紅染。因此將 AnnexinV 與 PI 匹配使用，就可以將凋亡早晚期的細(xì)胞及死細(xì)胞區(qū)分開(kāi)來(lái)。 TUNEL 法 該 方 法 稱(chēng) 為 脫 氧 核 糖 核 苷 酸 末 端 轉(zhuǎn) 移 酶 介 導(dǎo) 的 缺 口 末 端 標(biāo) 記 法 (terminaldeoxynucleotidyl transferase mediated niek end labeling， TUNEL)， 1992 年 Gavrieli 等首先報(bào)道了該方法。在細(xì)胞凋亡中，染色體 DNA 雙鏈斷裂或單 鏈斷裂而產(chǎn)生大量的粘性 339。OH 末端，而正常的或正在增殖的細(xì)胞幾乎沒(méi)有 DNA 的 斷裂，因而沒(méi)有 339。OH 形成。該方法可用細(xì)胞懸液、細(xì)胞涂片、載玻片上的粘連細(xì) 胞、冰凍組織或石蠟包埋組織為 檢測(cè)標(biāo)本，可在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶 (TdT) 的作用下，將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶或生物素形成的 衍生物標(biāo)記到 DNA 的 339。OH 末端，從而進(jìn)行凋亡細(xì)胞的檢測(cè)。原位 TUNEL 法快速， 其反應(yīng)全過(guò)程僅需約 3 h，其靈敏度及特異性都較高，尤其適用于作有關(guān)細(xì)胞凋亡 與相關(guān)基因表達(dá)關(guān)系方面的研究。 DNA 電泳 細(xì)胞發(fā)生凋亡是內(nèi)源性 NUC1 DNaseⅠ 和 DNaseⅡ 等核酸內(nèi)切酶活性所致。經(jīng) 這些內(nèi)切酶切割使核小體間斷裂，產(chǎn)生大小不同的片段，但都是 180～ 200 bp 的整 數(shù) 15 倍。凋亡細(xì)胞中提取的 DNA 進(jìn)行常規(guī)的瓊脂糖凝膠電泳，并用 EB 進(jìn)行染色時(shí)， 這些大小不同的 DNA 片段就呈現(xiàn)出梯狀條帶 [29]。而壞死細(xì)胞 DNA 電泳后則呈模糊的 涂片狀。絕大多數(shù)凋亡細(xì)胞中 DNA 的斷裂都表現(xiàn)出這種典型特征。 6 細(xì)胞因子對(duì)牛體外受精胚胎細(xì)胞凋亡的影響 PCR 技術(shù)檢測(cè) 在細(xì)胞凋亡的機(jī)理研究中，發(fā)現(xiàn)了很多表達(dá)異常的基因，檢測(cè)這些特異基因的 表達(dá)水平也是檢測(cè)細(xì)胞凋亡的一種方法。 PCR 即是檢測(cè)這些特異性基因的常用方法。 如 LMPCR 被用來(lái)擴(kuò)增凋亡細(xì)胞產(chǎn)生的 DNA 片段。當(dāng)瓊脂糖凝膠電泳呈現(xiàn)的 DNA 梯形 條帶不明顯時(shí)，用 LMPCR 擴(kuò)增后再電泳可見(jiàn)明顯的梯形圖譜 [30]。又如 RTPCR 被用 來(lái)檢測(cè) Bcl2 和 Bax 基因表達(dá)水平的比例，根據(jù)其比例分析細(xì)胞是存活還是凋亡。 近年來(lái)隨著熒光定量 PCR 技術(shù)的發(fā)展，用定量 PCR 技術(shù)檢測(cè)基因表達(dá)水平更快更準(zhǔn) 確。此外，將 PCR 技術(shù)和核酸分子雜交技術(shù)相結(jié)合，能顯著提高檢測(cè)的特異性和靈 敏度。 ELISA 法分析組蛋白 細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)， Ca2+、 Mg2+依賴(lài) 性?xún)?nèi)源核酸內(nèi)切酶被激活，在核小體連接區(qū)切 開(kāi)雙鏈 DNA，產(chǎn)生帶有單個(gè)或寡聚核小體的 DNA 片段。而核小體 DNA 與中心組蛋白 H2A， H2B， H3 和 H4 緊密結(jié)合，又可以防止核酸內(nèi)切酶的切割作用，故產(chǎn)生的 DNA 片段是 180～ 200 bp 的整數(shù)倍，并在凋亡細(xì)胞的胞漿中出現(xiàn)核小體或寡聚核小體。 該法是利用 “夾心定量酶標(biāo)免疫測(cè)定法 ”的原理，用抗組蛋白－生物素和抗 DNA－ 過(guò)氧化物酶（ POD）分別結(jié)合到核小體的組蛋白和 DNA 成分上，洗滌除去未結(jié)合的抗 體后，加入 POD 底物產(chǎn)生顏色反 應(yīng)。通過(guò)酶標(biāo)測(cè)定儀分析，即可定量反映細(xì)胞凋亡 的水平。該方法的優(yōu)點(diǎn)是：靈敏度高、操作快捷、無(wú)放射性同位素污染?？啥繙y(cè) 定細(xì)胞凋亡，無(wú)需預(yù)先標(biāo)記細(xì)胞，所用抗體不具有種屬特異性， POD 標(biāo)記的抗 DNA 抗體可與單鏈和雙鏈的 DNA 起反應(yīng)?？贵w夾心酶聯(lián)免疫分析法可以測(cè)定核小體單體 和寡聚核小體，因而可以用于許多不同的培養(yǎng)細(xì)胞株或動(dòng)物組織細(xì)胞的凋亡檢測(cè)。 線粒體膜勢(shì)能的檢測(cè) 線粒體在細(xì)胞凋亡的過(guò)程中起著樞紐作用，多種細(xì)胞凋亡刺激因子均可誘導(dǎo)不 同的細(xì)胞發(fā)生凋亡，而線粒體跨膜電位 DYmt 的下降，被 認(rèn)為是細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)過(guò) 程中最早發(fā)生的事件，它發(fā)生在細(xì)胞核凋亡特征（染色質(zhì)濃縮、 DNA 斷裂）出現(xiàn)之 前，一旦線粒體 DYmt 崩潰，則細(xì)胞凋亡不可逆轉(zhuǎn)。線粒體跨膜電位的存在，使一些 親脂性陽(yáng)離子熒光染料如 Rhodamine 12 Tetrechlorotetraethylbenzimidazol carbocyanine iodide(JC1)、 Tetramethyl rhodaminemethyl ester(TMRM)等可結(jié) 合到線粒體基質(zhì)，其熒光的增強(qiáng)或減弱說(shuō)明線粒體內(nèi)膜電負(fù)性的增高或降低 ，從而 判定凋亡與否。 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文 7 Caspase3 活性的檢測(cè) Caspase 家族在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過(guò)程中起著非常重要的作用，其中 Caspase3 是關(guān)鍵的執(zhí)行分子，它在凋亡信號(hào)傳導(dǎo)的許多途徑中發(fā)揮功能。 Caspase3 通常以 酶原（ 32 KD16）的形式存在于胞漿中，在凋亡的早期階段被激活，活化的 Caspase3 由兩個(gè)大亞基（ 17KD）和兩個(gè)小亞基（ 12 KD）組成，裂解相應(yīng)的胞漿胞核底物，最 終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。但在細(xì)胞凋亡的晚期和死亡細(xì)胞， Caspase3 的活性明顯下降。 總之，檢測(cè)細(xì)胞凋亡的方法很多，但都有其自身的缺點(diǎn)和局限性。目前對(duì)凋亡 細(xì)胞的檢測(cè)常規(guī)采用形態(tài)學(xué)檢查和 DNA 電泳分析，更靈敏的方法可采用流式細(xì)胞儀 檢測(cè)法、 TUNEL 及 ELISA 法等。本實(shí)驗(yàn)采用 TUNEL 方法和激光共聚焦顯微鏡結(jié)合的 方式檢測(cè)細(xì)胞凋亡。 胚胎細(xì)胞凋亡研究展望 在哺乳動(dòng)物中，雌性生殖細(xì)胞的存活與凋亡調(diào)控是多因子參與的復(fù)雜調(diào)節(jié)過(guò)程。 大約 90%的未成熟卵母細(xì)胞能在體外達(dá)到核成熟，并有 80%能經(jīng)歷受精、卵裂并發(fā)育 到 2 細(xì)胞階段，然而 發(fā)育到囊胚階段的僅達(dá)到 40%，要遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于體內(nèi)受精后的囊胚 發(fā)育率。采取有效檢測(cè)方法確定卵母細(xì)胞和胚胎的凋亡機(jī)制，對(duì)提高體外授精的囊 胚率有重要意義。這對(duì)家畜進(jìn)行體外受精并規(guī)?；a(chǎn)以及瀕危動(dòng)物的人工繁殖等 都非常有意義。 Coskun 和 Erickson 等的研究表明，表皮生長(zhǎng)因子（ EGF）、胰島素樣生長(zhǎng)因子 （ IGF）、轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)因子 (TGF)等生長(zhǎng)因子都能不同程度地促進(jìn)小鼠、大鼠、牛、豬、 倉(cāng)鼠等卵母細(xì)胞的體外成熟。 Brucker 等的研究發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)因子的作用必須通過(guò)卵丘 細(xì)胞介導(dǎo)，對(duì)裸卵無(wú)作用。在各 種生長(zhǎng)因子中， EGF 在卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)中應(yīng)用較 多， EGF 是顆粒細(xì)胞強(qiáng)有力的分裂素，也可能是卵母細(xì)胞成熟分裂恢復(fù)的一種信號(hào) 因子。 Coskun 等報(bào)道 EGF 能顯著提高牛成熟卵母細(xì)胞原核形成率，卵裂率及 4～ 8 細(xì)胞率。 Arellano 等的研究結(jié)果表明， EGF 能顯著提高豬卵母細(xì)胞的體外成熟率。 Merlo 等培養(yǎng)貓卵母細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn)，盡管 EGF 對(duì)卵母細(xì)胞胞核成熟沒(méi)有顯著影響，但 卻能顯著提高卵裂率和囊胚率。半胱胺（ CYS）是一種含有硫醇成分的谷胱甘肽（ GSH） 前體，能夠在卵丘 卵母細(xì)胞復(fù)合 體（ COCs）內(nèi)合成 GSH 并提高其含量。據(jù)研究， CYS 能夠細(xì)胞質(zhì)成熟，在體外受精中促進(jìn)雄原核的形成。有些研究顯示， CYS 對(duì)卵母細(xì)