【正文】 GSH 的合成通過 γ谷氨 酰循環(huán) （ γgluta。 CYS 是 GSH 的 前體，低分子量硫醇（ thiol）合成半胱胺 （ cysteamine CYS）能減少胱氨酸（ cystine）形成半胱氨酸（ cysteine）的幾率， 從而在卵母細胞成熟液添加 CYS 能增加 GSH 的合成。 GSH （ glutathione）是谷胱甘肽的縮寫。 CYS 在成熟液添加，對卵裂和囊胚沒有顯著作用而能夠促進孵化率的作用 機制目前還有待繼續(xù)研究。這些發(fā)現(xiàn)顯示， CYS 對卵母細胞成熟和胚胎發(fā)育的影 響，均與卵母細胞的供體物種和成熟狀態(tài)有 關(guān)。卵母細胞來自成年母 山羊時，成熟液添加 200uM 的 CYS 能促進囊胚的發(fā)育，但 100200uM CYS 濃度對性 成熟前的山羊體外發(fā)育卵裂率和囊胚發(fā)育率沒有顯著影響。 CYS 在卵母細胞成熟液和胚胎發(fā)育液均添加的時候，有顯著的促進成熟和發(fā)育 的作用，而且顯著降低胚胎細胞凋亡指數(shù)。 CYS 對卵母細胞成熟及胚胎發(fā)育的影響 在本研究中，添加 100uM CYS 對卵母細胞的成熟有一定促進作用，但是卵裂率 上沒有顯著表現(xiàn)出來，而在囊胚率上表現(xiàn)為提高效應。 EGF 的受體超家族之一的 erbB3 的轉(zhuǎn)錄因子，在胚胎 2細胞階段存在，而 4到 16 細胞階段不存 在，但在囊胚階段重新被檢測到。 EGF 促進卵母細胞減數(shù)分裂恢復和極體的形成，促進卵丘細胞的擴展。 EGF 在小卵泡中的濃度比大卵泡的濃度高，卵丘細胞能介導 EGF 的 影響，卵丘細胞數(shù)較少的羔羊與成年羊相比，生長因子的正常作用受到限制。 這種差異現(xiàn)象可能跟卵母細胞的供體卵泡環(huán)境有關(guān) [32]。在成年母牛 和小牛，成熟液添加 EGF 顯著提高卵母細胞卵裂率和囊胚率。 但是 EGF 對來源于羔羊的卵母細胞，只對其成熟有促進作用，而對囊胚率卻沒有影 響。 在本研究中，在成熟液中添加 EGF 顯著提高了牛卵母細胞成熟受精后的卵裂率 和囊胚率，這與 Guler 和 GrazulBilska 等的研究結(jié)果一致。 EGF 對卵母細胞成熟及胚胎發(fā)育的影響 有報道表明低濃度的 EGF（ 1,5,25ng/ml）對牛胚胎早期發(fā)育沒有顯著影響 [31]， 在本研究中比較了兩個較高濃度 EGF（ 50,100ng/ml）對牛卵母細胞成熟和胚胎發(fā)育 的影響。體外發(fā)育胚胎可通過改善培養(yǎng)環(huán)境，優(yōu)化培養(yǎng)體系來提高胚胎的質(zhì)量，推遲凋 亡出現(xiàn)的時間。 本實驗中胚胎最早出現(xiàn)的細胞凋亡時間是 16 細胞，有的研究顯示體外發(fā)育的 牛胚 胎， 8細胞期觀察到了細胞凋亡現(xiàn)象。體外發(fā)育跟體內(nèi)發(fā)育相比， 發(fā)育不同階段缺少關(guān)鍵生長因子等導致發(fā)育質(zhì)量受影響。 討論 本實驗的目的是在牛卵母細胞成熟液和胚胎發(fā)育培養(yǎng)液中添加不同細胞因子， 從卵裂率，囊胚率，囊胚細胞凋亡指數(shù)等參數(shù)來分析，細胞因子 EGF 和 CYS 對卵母 細胞成熟和胚胎發(fā)育的影響。成熟液加 EGF，發(fā)育液加 CYS 時對胚胎囊胚率產(chǎn)生了非 常顯著的促進作用 (%,%和 %,P),且這兩組凋亡指數(shù)也顯著低于 對照組（ , 和 ， P0,05），說明添加 EGF 和 CYS 能夠顯著改善胚胎 發(fā)育質(zhì)量。 組一，成熟液添加 EGF（ 50ng/ml） +CYS（ 100uM），發(fā)育液添加 CYS（ 100uM） 組二，成熟液添加 EGF（ 50ng/ml），發(fā)育液均添加 CYS（ 100uM） 組三，發(fā)育液添加 CYS（ 100uM） 表 5 EGF 和 CYS 對牛卵母細胞成熟和體外受精胚胎發(fā)育的影響 Effect of EGF and CYS in bovine oocytes maturation and IVF embryo development M199 CR1 卵母細胞 卵裂數(shù)（ %） 囊胚數(shù)（ %） 凋亡指數(shù)（ AI） 對照組 180 141（ ） b41（ ） c E+ C+ C+ 180 158（ ） a64（ ） a E+ C C+ 180 159（ ） a 66（ ） a E C C+ 180 144（ ） b 52（ ） b 注： 同列數(shù)據(jù)后面標注的不同小寫字母表示差異顯著（ P＜ ），相同的小寫字母表示差異不顯著（ P）； E 表示 EGF， C 表示 CYS， +表示添加， 表示沒添加 16 細胞因子對牛體外受精胚胎細胞凋亡的影響 由表得出，成熟液添加 EGF（ 50ng/ml） ,同時在發(fā)育液添加 CYS（ 100uM），可以 提高牛卵母細胞受精后的卵裂率和囊胚率，這進一步說明 EGF 對成熟有促進作用。說明 CYS 對胚胎囊胚率有明顯促進作用，能夠顯著降 低胚胎細胞凋亡。 表 4 不同濃度 EGF 或 CYS 對牛體外受精胚胎發(fā)育的影響 Effect of different concentrations of EGF or CYS on bovine IVF embryo development 添加因子濃度 卵母細胞 卵裂數(shù)（ %） 囊胚數(shù)（ %） 凋亡指數(shù)（ AI） 對照組 230 185（ ） a 54（ ） b EGF（ ng/ml） 50 230 186（ ） a 57（ ） b 100 230 182（ ） a 53（ ） b CYS(uM) 100 230 187（ ） a 71（ ） a 200 230 181（ ） a 52（ ） b 注： 卵裂率 =卵裂數(shù)除以卵母細胞總數(shù)；囊胚率 =囊 胚數(shù)除以卵裂數(shù)；同列數(shù)據(jù)后面標注的不同小寫字母表示差 異顯著（ P＜ ），相同的小寫字母表示差異不顯著（ P） 由表得出， EGF 對胚胎囊胚率沒有影響。 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學碩士學位論文 15 試驗三 不同濃度 EGF 或 CYS 對牛體外受精胚胎發(fā)育的影響 根據(jù)試驗一的結(jié)果，胚胎全部培養(yǎng)到第八天，經(jīng)過固定，通透，抽樣做了 TUNEL 染色，激光共聚焦觀察分析細胞凋亡。 100uM 濃 度的 CYS 對卵母細胞卵裂率 沒有顯著影響，但隨后的胚胎囊胚率有顯著的提高 （ %和 %,P），說明 CYS 對卵母細胞的成熟有一定促進作用，只是在 囊胚階段表現(xiàn)出來。 表 3 不同濃度 EGF 或 CYS 對牛卵母細胞成熟的影響 Effect of different concentrations of EGF or CYS on bovine oocytes maturation 添加因子 濃度 卵母細胞數(shù) 卵裂數(shù)（ %） 囊胚數(shù)（ %） 凋亡指數(shù)（ AI） 對照組 240 188（ ） b 54（ ） c EGF 50 240 208（ ） a 83()a （ ng/ml） 100 240 190（ ） b 59()c CYS 100 240 193（ ） b 70()b (uM) 200 250 189（ ） b 55()c 注 ： 卵裂率 =卵裂數(shù)除以卵母細胞總數(shù)；囊胚率 =囊胚數(shù)除以卵裂數(shù)；同列數(shù)據(jù)后面標注的不同小寫字母表示 差異顯著（ P＜ ），相同的小寫字母表示差異不顯著（ P） 由表得出， 50ng/ml 濃度 EGF 對卵母細胞的卵裂率提高顯著（ %和 %， P），從而對囊胚率有顯著影響，凋亡指數(shù)顯著低于對照組（ 和 ， P）。 16 細胞凋亡率為 26%，桑椹胚凋亡率為 83%，囊胚為 97%，擴展囊胚和孵化囊胚凋亡率為 100% 由表 2 得出， 7d 囊胚細胞凋亡指數(shù)比 8d 囊胚細胞凋亡指數(shù)顯著低，實驗中觀 察到發(fā)育速度快胚胎形態(tài)和發(fā)育能力都比發(fā)育 速度慢胚胎好。 內(nèi)蒙古 農(nóng)業(yè)大學碩士學位論文 13 結(jié)果 試驗一 胚胎發(fā)育各階段細胞凋亡情況 胚胎體外受精完成后，收集 2細胞， 3細胞， 4細胞， 8細胞， 16細胞，桑 椹胚，囊胚，擴展囊胚及孵化囊胚，固定和通透以后隨機抽樣做 TUNEL 染色處理， 用激光共聚焦顯微鏡檢測細胞凋亡。凋亡指數(shù)（ AI） 是胚胎發(fā)生凋亡的細胞在胚胎細胞總數(shù)所占的比率。 統(tǒng)計分析 所得實驗數(shù)據(jù)如卵裂率，囊胚率使用卡方檢驗分析，確定差異顯著性；胚胎的 凋亡細胞和細胞總數(shù)使用細胞計數(shù)軟件統(tǒng)計；細胞凋亡指數(shù)用 SAS 軟件分析差異性。 試驗三，胚胎發(fā)育液添加不同濃度 EGF（ 0， 50,100ng/ml）和 CYS（ 0,100,200uM） (1) 發(fā)育液添加 EGF（ 0， 50,100ng/ml） (2) 發(fā)育液添加 CYS（ 0,100,200uM） 與試驗一相同處理過程，分析對胚胎發(fā)育及胚胎細胞凋亡的影響。比較不同 發(fā)育階段囊胚（囊胚，擴張囊胚，孵化囊胚）之間的胚胎細胞凋亡情況。 （ 4）用激光共聚焦顯微鏡觀察細胞凋亡。 （ 3）抽樣做 TUNEL 染色處理，檢測細胞凋亡。 試驗一，比較牛不同發(fā)育階段胚胎細胞凋亡情況 （ 1）胚胎體外受精完成后，收集 2細胞， 3細胞， 4細胞， 8細胞， 16細胞， 桑椹胚，囊胚，擴 展囊胚及孵化囊胚。g/mLE2 +8181。g/mLFSH+10181。 制片并用激光共聚焦觀察 滅菌載玻片上放置 36 個胚胎，四周涂抹中性樹脂膠，輕輕蓋上蓋玻片，裝到 裝片的盒子，放 20℃ 保存，一周之內(nèi)用激光共聚焦觀察，照相，做統(tǒng)計分析。 RNAase 處理 實驗組，陰性對照組，陽性對照組三組做完 TUNEL 處理后，在 RNase+ RNAbuffer 中處理 40min，降解細胞質(zhì)內(nèi)的 RNA，去除干擾。 （ 2） TUNEL 陰性對照 為檢測熒光標記是否標上，作陰性對照，隨機挑選 23 個通透好的胚胎，用 TUNEL 處理時不加酶液，只在標記液中處理 12h。 設置各對照組 （ 1） TUNEL 陽性對照 為避免出現(xiàn)假陽性現(xiàn)象，設置陽性對照。實際操作如下：將從發(fā)育 液撿取的胚胎用 4%的多聚甲醛洗三遍，再移入多聚甲醛液滴中，固定 12h。 在 TUNEL 操作中，移胚胎的玻璃針勤換，以免在實驗組，陰性對照，陽性對照 中造成交叉污染，影響實驗結(jié)果的準確性。具體操作如下：在冰上的多孔板里做一個 9ul 的帶有 FITC 熒光的寡核苷酸標記液微滴，蓋上礦物油（避免在 ℃ 培 養(yǎng)箱孵育時操作液 的蒸發(fā)），迅速加 1ul 的 TdT 酶液，充分混合兩種物質(zhì)，標記液和酶液比例為 9:1， 然后快速將準備好的胚胎放入微滴中，將多孔板放到 ℃ ,5%CO2 培養(yǎng)箱孵育 12h。 TUNEL 試劑盒平時在 20℃ 凍存。當末端轉(zhuǎn)移 酶 TdT 將帶有 FITC 熒光標記的寡核苷酸片段連接到斷裂末端時，在熒光顯微鏡下會 觀察到被熒光標記的細胞，以判斷細胞發(fā)生了凋亡。 TUNEL 試劑盒工作原理 TUNEL 試劑盒（ Roche）含有酶液和熒光標記液。 胚胎培養(yǎng)及發(fā)育 卵母細胞做完體外受精后，培養(yǎng) 48h 后換半液。將培養(yǎng)皿 放回 ℃ ,5% CO2 恒溫培養(yǎng)箱共孵育 6h。 體外受精 將成熟培養(yǎng) 2224h 的卵母細胞取出，用受精液（ BO 液 +20ug/ml 肝素鈉）洗三 遍，轉(zhuǎn)入事先準備好并平衡 2h 以上的受精液滴里， 50ul 液滴放置 20 左右卵母細胞。精子進入卵母細胞后，核膜溶解，染色質(zhì)去致密化，同時刺 激卵母細胞恢復減數(shù)分裂，排出第二極體完成受精。 精子獲能 哺乳動物釋放的 精子不能立即使卵子受精，必須在雌性動物生殖道內(nèi)停留一段 時間才能獲得受精能力，此過程為精子獲能。 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學碩士學位論文 9 通常根據(jù) COCs 的卵胞質(zhì)和卵丘細胞形態(tài)，將 COCs 分為四級： A 級 COCs 為卵胞 質(zhì)均勻，卵丘細胞層完整且 3 層以上； B 級 COCs 為卵胞質(zhì)均勻，卵丘細胞 3 層以內(nèi) 或部分脫落； C 級為裸露的卵母細胞； D 級為退化的卵母細胞。L/mL PS)里清洗 3 遍， 轉(zhuǎn)入已平衡 2h 以上的 35mm 培養(yǎng)皿的微滴中 (每滴為 100181。g/mLLH+1181。L PS）中沖洗 3 遍，然后在成 熟培養(yǎng)液 (M199+10%FBS+10181。全部卵巢的卵泡液抽完將離心 管靜止 20min 左右，讓卵母細胞沉淀，去掉一半上清 卵泡液，將含有沉下的卵母細 胞的剩下卵泡液倒入滅菌培養(yǎng)皿，并放在恒溫電熱平板，準備撿卵。 從屠宰場收集牛的卵巢，放置于 30℃ 滅菌的 %生理鹽水中， 12h 內(nèi)送到實 驗室。第一 和第二種