【正文】 。 思考題 （ 2個(gè)以上細(xì)胞因子）。 ? 3 同時(shí)增強(qiáng)細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)的細(xì)胞因子 ? GMCSF是另外一種新型的免疫佐劑，能誘導(dǎo)分化、增殖和活化多種免疫活性細(xì)胞，它不僅可以刺激巨噬細(xì)胞的生成，還可以誘導(dǎo)體液免疫和細(xì)胞免疫。 ? 1 增強(qiáng)細(xì)胞免疫反應(yīng)的細(xì)胞因子 ? IFNγ ， IL2， IL12， IL15或 IL18會(huì)降低 IgGl/IgG2的比例，顯示 Thl傾向性，同時(shí)加強(qiáng)遲發(fā)型超敏反應(yīng)（ delayed type hypersensitivity,DTH） 和升高 CTL反應(yīng)。正如傳統(tǒng)疫苗可通過(guò)添加佐劑來(lái)增加其免疫作用一樣，基因工程疫苗也可通過(guò)添加佐劑來(lái)達(dá)到增強(qiáng)免疫作用的目的。 核酸疫苗通常比復(fù)制性完整的病原體的免疫原性差，需要多次免疫才能使動(dòng)物得到有效保護(hù)。 Yrina Rochman et al. Nature Bubbleboy (IL2R的 γ鏈缺陷引起 SCID) XSCID 基因治療原理 表達(dá)細(xì)胞因子 VEGF的腺病毒或裸 DNA直接體內(nèi)注射 治療梗塞性血管病 細(xì)胞因子佐劑 細(xì)胞因子在免疫應(yīng)答的產(chǎn)生和調(diào)節(jié)中具有重要作用，可作為免疫佐劑增強(qiáng)疫苗的免疫效果。 ： DAB389IL2免疫毒素治療 T細(xì)胞淋巴瘤 已批準(zhǔn)上市的 重組 細(xì)胞因子藥物 IFNα 白血病、 Kaposi肉瘤、肝炎、癌癥、 AIDS IFNγ 慢性肉芽腫、生殖器疣、過(guò)敏性皮炎、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎 GCSF 自身骨髓移植、化療導(dǎo)致的粒細(xì)胞減少癥、 再生障礙性貧 血 GMCSF 自身骨髓移植、化療導(dǎo)致的血細(xì)胞減少癥、 再生障礙性貧血 Epo 慢性腎衰導(dǎo)致貧血、癌癥或癌癥化療導(dǎo)致的貧血 、 失血后貧血 IL2 癌癥、免疫缺陷、疫苗佐劑 IFNβ 多發(fā)性硬化癥 IL11 放化療所致血小板減少癥 SCF 與 GCSF聯(lián)合應(yīng)用與外周血干細(xì)胞移植 EGF 外用藥治療燒傷、潰瘍 bFGF 外用藥治療燒傷、外周神經(jīng)炎 FDA批準(zhǔn)上市的細(xì)胞因子 抑制劑 ? 美國(guó) FDA2022年 11月批準(zhǔn)上市的 IL1ra（ Kineret），治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎 治療： 炎癥和自身免疫病； T細(xì)胞淋巴瘤、白血??； 移植排斥等 白喉毒素片段（ 389aa） IL2 治療 T細(xì)胞淋巴瘤的細(xì)胞因子免疫毒素 DAB389IL2結(jié)構(gòu)示意圖 我國(guó)已批準(zhǔn)進(jìn)入臨床的基因治療項(xiàng)目： P53腺病毒治療腫瘤（批準(zhǔn)上市） IX因子基因治療血友病 缺失突變腺病毒（ H101）治療腫瘤 VEGF裸 DNA治療梗塞性外周血管病 TK基因治療惡性腦膠質(zhì)瘤 IL2基因瘤苗治療胃癌 XSCID的 IL2受體 ?鏈基因治療（ 2022年法國(guó)報(bào)道 2例，迄今 11例， 10例成功）。 細(xì)胞因子的臨床應(yīng)用舉例 重組細(xì)胞因子 ： IFNα 治療肝炎； GMCSF,GCSF治療白細(xì)胞減少。 免疫學(xué)檢測(cè)法 (1) ?可溶性細(xì)胞因子檢測(cè) : – 放射免疫測(cè)定（ RIA） 特異 Ab包被 +待測(cè)樣品和同位素標(biāo)記的細(xì)胞因子 竟?fàn)幰种茖?shí)驗(yàn) – 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ ELISA） 雙抗體加心法 – Western Blot – 檢測(cè)單個(gè)細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子：細(xì)胞斑點(diǎn)、酶聯(lián)斑點(diǎn) 免疫學(xué)檢測(cè)法 (2) ? 細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞膜上的細(xì)胞因子的研究 – 檢測(cè)單個(gè)細(xì)胞結(jié)合的細(xì)胞因子：生物素、堿性磷酸酶、免疫熒光 – 檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞因子 細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞因子的熒光檢測(cè) 分子生物學(xué)檢測(cè) ? Southern Blot ? Northern Blot ? 原位雜交 ? RTPCR 體內(nèi)功能研究 ? 基因敲除、轉(zhuǎn)基因 ? 利用特異性抗體觀察細(xì)胞因子在體內(nèi)的生物學(xué)作用 細(xì)胞因子的應(yīng)用 ? 在臨床治療： ? 重組細(xì)胞因子： – 抗腫瘤細(xì)胞因子： IL IFNa – 促進(jìn)造血的細(xì)胞因子： GCSF、 GMCSF、 EPO、 IL11 – 最近發(fā)現(xiàn)細(xì)胞因子可以增強(qiáng)化療藥治療白血病的療效。 ? transwell侵襲實(shí)驗(yàn)，原理簡(jiǎn)單地說(shuō)就是用一層膜將高營(yíng)養(yǎng)的培養(yǎng)液和低營(yíng)養(yǎng)的培養(yǎng)液隔開(kāi)，細(xì)胞放在低營(yíng)養(yǎng)的培養(yǎng)液里，為了找吃的，細(xì)胞會(huì)往高營(yíng)養(yǎng)的培養(yǎng)液里面跑，但是有膜擋著，所以要穿過(guò)膜才行。 ? 腫瘤細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 、 ，上室種腫瘤細(xì)胞，下室加入 FBS或某些特定的趨化因子，腫瘤細(xì)胞會(huì)向營(yíng)養(yǎng)成分高的下室跑，計(jì)數(shù)進(jìn)入下室的細(xì)胞量可反映腫瘤細(xì)胞的遷移能力。 ? Transwell ? 將 Transwell小室放入培養(yǎng)板中，小室內(nèi)稱上室，培養(yǎng)板內(nèi)稱下室，上室內(nèi)盛裝上層培養(yǎng)液，下室內(nèi)盛裝下層培養(yǎng)液，上下層培養(yǎng)液以聚碳酸酯膜相隔。細(xì)胞增殖越多越快，則顏色越深；細(xì)胞毒性越大，則顏色越淺。 ? Cell Counting Kit8簡(jiǎn)稱 CCK8試劑盒，是一種基于 WST8的廣泛應(yīng)用于細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性的快速高靈敏度檢測(cè)試劑盒。於 37℃ CO2 培 養(yǎng) 箱 2天後，加入 1 μCi/well 3H胸腺嘧啶（ thymidine） ， 繼續(xù)培養(yǎng) 8小 時(shí)后 ，以 cell harvester 收集 細(xì) 胞 于濾紙 上， 風(fēng)干后 以 閃爍計(jì)數(shù)儀測(cè) 3Hthymidine 含量， 計(jì)算細(xì)胞增殖 能力。 細(xì)胞因子的檢測(cè) ? 用于判斷機(jī)體免疫功能，進(jìn)行疾病輔助診斷，判斷病程，預(yù)后，評(píng)價(jià)治療效果 細(xì)胞因子檢測(cè)常用方法 ? 生物活性檢測(cè)法 (biossay)檢測(cè)細(xì)胞因子的生物學(xué)活性 ? 免疫學(xué)檢測(cè)法 (immnuossay)檢測(cè)細(xì)胞因子蛋白質(zhì)的抗原特性 ? 分子生物學(xué)檢測(cè)法 檢測(cè)細(xì)胞因子的 mRNA表達(dá) 生物 活性 檢測(cè)法 ? 增殖實(shí)驗(yàn) ： 應(yīng)用某一細(xì)胞因子能特異刺激或抑制某些指示細(xì)胞的增殖 ,通過(guò) [3H]TdR攝入 ,MTT,反應(yīng)待測(cè)細(xì)胞因子的活性水平 。 ? 急性肺損傷 /急性呼吸窘迫綜合癥：是在致病因子的作用下發(fā)生的過(guò)度炎癥反應(yīng)，細(xì)胞因子 TNF,IL8， IL1β 等在其發(fā)生發(fā)展中都起了重要的作用。 ? ? 抑郁癥：抑郁癥狀在多發(fā)性硬化、 過(guò)敏性疾病、 中風(fēng)及風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等這類非感染性慢性免疫激活性疾病中較為常見(jiàn)。如 IL 1 1 TNFα 、 IFNγ 等。 細(xì)胞因子與臨床 ? 細(xì)胞因子及受體缺陷 ? 細(xì)胞因子過(guò)高表達(dá) ? 可溶性受體水平升高 ? 炎癥性細(xì)胞因子 ? 近年來(lái)炎癥性細(xì)胞因子由于其在介導(dǎo)炎癥炎癥和許多疾病中的關(guān)鍵作用而備受關(guān)注，主要是 IL1 TNFα、 IFNγ、 IL6和 IL1β等。 促 CTL殺傷： IL2， 6， IFNγ 。 The EMBO Journal (2022), 1–10 CKR在 DC遷移和功能成熟中具有不同的表達(dá)模式 CXCL8參與 Neu的遷移和活化 趨化因子參與免疫細(xì)胞在周圍免疫器官的定位 趨化因子及其受體在免疫系統(tǒng)的表達(dá)和功能 Ye H. Oo et al, Journal of Autoimmunity 34 (2022) 45–54. （ 1） B：促增殖、活化、分化： IL4， 5， 6， 13， BAFF； 調(diào)控 Ig類別轉(zhuǎn)換： IL4， 5等。 （ 6） γδ T：激活（ IL1， 7， 12， 15）。 （ 4） NK：促分化（ IL15）；促殺傷（ IL2, 12, 15, 18）。：定向遷移（ CCL18,1215）、活化（ IFNγ ，GMCSF, MCSF）、促抗原提呈 (IFNγ )。 免疫調(diào)節(jié) 固有免疫： （ 1） DC：定向遷移（ CCL3， 4， 5， 7； CCL19， 21 ）；促成熟（ IL1β 、 TNFα ）；促抗原提呈 (IFNγ ) 。 淋巴樣干細(xì)胞： IL7。 造血干 /祖細(xì)胞： IL3， SCF。 B細(xì)胞和 T細(xì)胞活化過(guò)程中，常需要兩種以上細(xì)胞 因子的協(xié)同作用或彼此調(diào)節(jié) 。 ? IL1受體拮抗劑 ? 病毒產(chǎn)生的細(xì)胞因子結(jié)合蛋白， TNF， IL1 細(xì)胞因子受體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo) ?細(xì)胞因子受體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)主要利用 2個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑： – JAK(Janus kinase)STAT – Ras－ MAPK激酶途徑 細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo) Cytokine induced signal transduction 細(xì)胞因子結(jié)構(gòu)與功能特點(diǎn) ? 結(jié)構(gòu)：同源性低，小分子蛋白，多為單鏈，少為雙鏈、三聚體（ TNF）、多含糖基 ? 量微而活性強(qiáng)（ pmol/L） 細(xì)胞因子作用是作為細(xì)胞之間的信使 細(xì)胞因子作用特點(diǎn)： ? 旁分泌或自分泌，瞬時(shí)、距離范圍小 ? 通過(guò)與相應(yīng)受體結(jié)合發(fā)揮作用 ? 細(xì)胞因子誘導(dǎo)的受體亞單位聚合可以活化蛋白酪氨酸激酶 (JAK),導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子 STAT酪氨酸磷酸化而激活靶基因轉(zhuǎn)錄 ? 多效性、重疊性、拮抗性、協(xié)同性、網(wǎng)絡(luò)性： 生理調(diào)節(jié)、病理反應(yīng) 90 細(xì)胞因子間可相互誘生： IL1能誘生 IFN、 IL IL IL4等， IL2能誘生 TNF、 IL LT等。 (sCKR) ? 產(chǎn)生方式： – 大部分為膜受體脫落，如 SIL1R、 SIL 2R、 sTNFR