分子細胞遺傳學技術與產(chǎn)前診斷-文庫吧資料
2024-07-31 10:59本頁面
【正文】 技術路線：血細胞 RNA?cDNA?RTPCR?體外蛋白質(zhì)合成 ?電泳分析截短了的蛋白質(zhì) ?相應基因片段的序列分析 ? 上游引物 5’端均連接 T7啟動子序列GGATCCTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACCATGG ? [35S]甲硫氨酸， T7 體外轉(zhuǎn)錄 /翻譯體系（兔網(wǎng)織紅細胞提取物）， 30℃ 孵育 90 min，完成體外蛋白質(zhì)合成。 （ PTT） ? 從蛋白質(zhì)水平檢測基因的突變 。 10%聚丙烯酰胺凝膠電泳 。 即使只有一個堿基的不同 ， 也會形成不同的二級結(jié)構并可引起非變性條件下的電泳遷移率的差異 。 10%聚丙烯酰胺凝膠電泳 （ %硝酸銀染色 ） （ DGGE） ? 利用不同 DNA序列開始變性時對變性劑濃度的要求不同，在變性劑濃度梯度凝膠內(nèi)電泳，野生型 DNA和突變型 DNA序列的差異所導致其變性點不同使兩者的電泳遷移率出現(xiàn)差異 （ SSCP） ? 單鏈 DNA在中性條件下會形成二級結(jié)構 。 548: 97105 （三）目前常用的 未知 基因突變分析技術 ? 異源雙鏈體形成分析 （ Heteroduplex analysis, HA） ? 單鏈構象多態(tài)性分析 （ Singlestrand conformation analysis, SSCP） ? 變 性 梯 度 凝 膠 電 泳 （ denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE） ? 變性高效液相色譜分析 （ Denaturing high performance liquid chromatography, DHPLC ） 體外蛋白截短實驗 （ Protein truncation test, PTT） 定量多重 PCR技術 （ Quantitative multiplex PCR, QMPCR） 多重探針連接依賴性擴增技術 （ Multiplex Ligationdependent Probe Amplifcation, MLPA) DNA序列分析 （ DNA sequencing) （ HA） ? 由突變型和野生型 DNA鏈形成的異源雙鏈 DNA在其錯配處形成一個凸起 ， 電泳時會產(chǎn)生與相應的同源雙鏈 DNA不同的遷移率 ， 從而使兩者得以分離 。 （ ASO） ? 設計兩段寡核苷酸探針，其中包含發(fā)生突變的位點， 一段與野生型鏈互補 ， 一段與突變型鏈互補 。 各種類型病理性突變的比例 1. 無義突變和移碼突變： 60％ 2. 稀有的錯義突變： 20％ 3. DNA大片段缺失或重復 : 20％ 另外：可能和疾病風險評估有關的大量的多態(tài)位點 微小突變 （二） 目前常用的對 已知 點突變的分析技術 ? 限制性片段長度多態(tài)性（ RFLP） ? 等位基因特異性（ PCR）擴增（ ASA） ? 等位基因特異性寡核苷酸雜交（ ASO） ? DNA芯片 （ RFLP）分析 ? 當突變影響到某一限制性內(nèi)切酶位點時，可通過酶切 PCR產(chǎn)物，電泳分析 :限制性片段長度多態(tài)
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