農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法的概述-文庫吧資料
2025-07-03 08:27本頁面
【正文】 造傷，使農(nóng)桿菌通過傷口感染植株，在農(nóng)桿菌的介導(dǎo)下，發(fā)生遺傳轉(zhuǎn)化。 選取健康的無菌苗，用打孔器打出葉圓盤，將帶有新鮮傷口的葉圓盤與載有目的基因的農(nóng)桿菌液進(jìn)行短期共培養(yǎng)，農(nóng)桿菌通過傷口使攜帶外源目的基因的Ti或Ri質(zhì)粒進(jìn)入植物細(xì)胞，使外源目的基因整合到植物基因組中?，F(xiàn)將農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物遺傳轉(zhuǎn)化常采用的方法[9]，簡要介紹如下：通常使用的是第一種方式。②將整塊愈傷組織浸泡于菌液中搖動培養(yǎng)。利用農(nóng)桿菌與植物離體組織共培養(yǎng)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，一般需要經(jīng)過嚴(yán)格的組織培養(yǎng)過程以再生植株，因而轉(zhuǎn)化周期比較長。TDNA通過與事先斷裂的寄主DNA雙鏈(DSB)發(fā)生重組來完成整合，進(jìn)而進(jìn)行表達(dá)。TDNA整合進(jìn)宿主細(xì)胞基因組，是轉(zhuǎn)化過程中最重要也最關(guān)鍵的步驟。被取代的舊鏈游離出來，與許多VirE2蛋白分子結(jié)合組成TDNA復(fù)合體。bp重復(fù)序列和第四個堿基之間切割，將TDNA從Ti質(zhì)粒上剪切下來，稱T鏈。VirD基因編碼的兩個產(chǎn)物VirD1和VirD2直接參與加工過程．VirD1蛋白是一種拓?fù)洚悩?gòu)酶，可將超螺旋型DNA變成松弛型DNA．VirD2蛋白具有特異剪切單鏈DNAvir基因表達(dá)的產(chǎn)物作用于TDNA產(chǎn)生TDNA鏈，進(jìn)而轉(zhuǎn)化形成TDNA復(fù)合體，隨后在植物及細(xì)菌蛋白的共同作用下被攝入細(xì)胞核內(nèi)。以加強(qiáng)As對Vir基因的誘導(dǎo)結(jié)合活化蛋白，可以以二體或多體形式結(jié)合到vir啟動子的特定區(qū)域，從而成為其它vir基因轉(zhuǎn)錄的激活因子，打開VirB、virC、virD、virE、virH等幾個基因。VirGVirA蛋白的胞質(zhì)區(qū)域有自激酶的功能，Vir區(qū)基因的活化首先是從virA基因開始的。當(dāng)農(nóng)桿菌接受到此類信號時(shí)，其vir區(qū)基因可被誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄。在植物受到創(chuàng)傷后，創(chuàng)傷組織的細(xì)胞釋放出酚類化合物信號，轉(zhuǎn)化過程農(nóng)桿菌介導(dǎo)的TDNA的轉(zhuǎn)移和整合是細(xì)菌和植物細(xì)胞相互作用發(fā)生生物學(xué)效應(yīng)的過程，兼具原核生物中的細(xì)菌結(jié)合轉(zhuǎn)移及真核細(xì)胞加工修飾的特點(diǎn)。2TDNA區(qū)的TL區(qū)具有較高的穩(wěn)定性，TR區(qū)具有與生長素合成有關(guān)的基因tmsl和tms2及農(nóng)桿堿或甘露堿合成基因。轉(zhuǎn)移機(jī)制也類似，所不同的是vir區(qū)和TDNA區(qū)所含基因及其同源性不同。rhizogenes)含有Ri質(zhì)粒，能夠誘導(dǎo)被侵染的植物細(xì)胞產(chǎn)生毛發(fā)狀根。發(fā)根農(nóng)桿菌在遺傳轉(zhuǎn)化過程中除了Ti質(zhì)粒上的基因參與外，還有農(nóng)桿菌染色體基因．染色體基因包c(diǎn)hvA、chvB、att、pscA、chvD以及chvB．它們大多編碼一些膜相關(guān)蛋白，負(fù)責(zé)細(xì)菌向植物受傷細(xì)胞趨化移動和幫助細(xì)菌附著于植物受傷細(xì)胞上。(ori區(qū))：該區(qū)段調(diào)控Ti質(zhì)粒的自我復(fù)制。(Con區(qū))：該區(qū)段存在有與細(xì)菌間接合轉(zhuǎn)移有關(guān)的基因(tra)，調(diào)控Ti質(zhì)粒在農(nóng)桿菌間轉(zhuǎn)移。目前，對章魚堿型農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒pTi15955和胭脂堿型農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒pTiC58的vir區(qū)進(jìn)行了全序列分析，在章魚堿型Ti質(zhì)粒的vir區(qū)發(fā)現(xiàn)了8個操縱子，分別為virAvjrH，共包括23個基因(virA，virB1virB11，virC1，virC2，virD1virD4，virE1，virE2，virF，virG，virH)．而胭脂堿
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